單鏈高分子質量載體DNA的制備

材料與儀器

待轉化的酵母菌株
DNA (從鮭魚精巢制備的DNA III型鈉鹽 Sigma #D1626) l×TE緩沖液 pH 8.0 緩沖液平衡酚 1: 1 (W)酚 氯仿 氯仿 3 mol L 乙酸鈉 pH 5.2 100%乙醇 冰冷
超聲波發生器

步驟

1) 將DNA溶于pH 8.0的1×TE緩沖液，終濃度為10 mg/mL，于4℃攪拌過夜。 因每一次轉化需要用200 載體DNA,制備大量的載體DNA Gnig)并于-20℃凍存分裝很有用。

2) 用一個大的超聲探頭，在75%的最大功率下超聲處理DNA 30 s，以降低DNA溶液 的黏度。取1 mg DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢查超聲剪切后片段大小的分布。如果有必要，可重復超聲處理，直到獲得適當的片段大小分布：片段大小范圍為2?15 kb,平均大小約為7 kb。

3) 用緩沖液平衡酚抽提1次，酚/氯仿抽提1次，最后用氯仿抽提1次。

4) 加入1/10體積的3 mol/L，pH 5.2的乙酸鈉緩沖液，2. 5體積的冰冷100%乙醇沉淀DNA。

5) DNA沉淀用1×TE緩沖液重懸，最終濃度10 mg/mL。重懸沉淀可能需要在4℃攪拌過夜。

6) 將載體DNA移至一個Pyre×耐熱玻璃燒瓶中，在微波爐中加熱煮沸2?3　min。

7) 迅速置冰浴中冷卻，用無菌試管分裝后于-20℃凍存DNA。