LncRNA相關研究思路
LncRNA介紹
lncRNA在癌癥疾病方面的研究已逐漸深入，lncRNA的突變或失調與癌細胞的發生密切相關，廣大學者通多方面的研究來解釋兩者之間的關系，為疾病的診斷和潛在的藥物靶點提供了，新型靶向治療方案。
一、lncRNA的特點
（1）長度大于200nt的非編碼RNA，部分lncRNA含有polyA尾巴；
（2）部分lncRNA可與核糖體結合，但沒有或只有較弱的蛋白編碼能力；
（3）相對mRNA，lncRNA的保守性較低；
（4）lncRNA的表達具有組織特異性以及時間特性。
二、lncRNA的功能
lncRNA通過折疊形成一定的空間結構與多種蛋白互作，也可通過堿基互補配對與其它核酸進行識別，這種識別又可將蛋白引導至特定序列位點，使得lncRNA在發育和癌癥中的功能發揮途徑更加豐富。
LncRNA參與基因的表達調控，可從表觀修飾水平，轉錄水平和轉錄后水平發揮功能，主要的方式如下:
（1）結合轉錄因子，干擾其與promoter結合，從而調控轉錄；
（2）吸附miRNA，抑制其與mRNA結合，使得mRNA免于降解；
（3）作為蛋白互作的橋梁，影響蛋白多聚物的形成，調控蛋白活性；
（4）與mRNA配對結合，影響mRNA的穩定性。
三、lncRNA序列的查找
通過NCBI網站可查找目的lncRNA的序列，具體方法如下：NCBI-Gene-輸入基因名稱-Search-選擇對應物種基因-點擊進去-往下拖，選擇NR編號，該序列即為lncRNA全長。
四、相關質粒構建及實驗分析
（1）lncRNA的過表達
①普通表達載體：選用任何真核表達載體既可，如p0157/pCDNA3.1(+)，p23835/pEnCMV-EGFP-Linker-MCS等哺乳細胞載體。將目的lncRNA基因構建到目的載體中，并轉染細胞（如人293T細胞），通過藥性篩選以及傳代篩選，得到穩定的的細胞株系；提取穩定細胞株的總RNA，反轉錄成cDNA，以其為模板，進行實時熒光定量PCR檢測其相對表達量；
②慢病毒表達載體：選用任何可用于慢病毒表達的載體既可，如表達載體p0268/pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro，p0247/pLVX-Puro等，輔助包裝質粒p0261/psPAX2，p0700/pRSV-Rev，p0264/pLP1，p0265/pLP2，p0266/pLP-VSVG等。將目的lncRNA基因構建到目的載體中，與輔助包裝質粒共轉染到細胞中（如人293T細胞），培養一段時間后，檢測病毒滴度，一般通過熒光蛋白表達情況計算慢病毒滴度；并用抗生素進行篩選穩定細胞株，通過顯微鏡觀察綠色熒光，獲得慢病毒感染的穩定細胞株，并進行實時熒光定量PCR檢測其相對表達量。
（2）lncRNA的亞細胞定位：構建熒光蛋白融合表達載體，如p0134/pEGFP-C1，p0151/pmCherry-C1等，通過FISH（Fluorescence in Situ Hybridization）驗證其亞細胞定位。
（3）lncRNA的干擾表達：慢病毒干擾載體p0255/pLKO.1-EGFP，p0256/pLKO.1，p0684/pLVshRNA-EGFP(2A)Puro等，及輔助包裝質粒p0261/psPAX2，p0700/pRSV-Rev，p0264/pLP1，p0265/pLP2，p0266/pLP-VSVG等。根據NCBI上的lncRNA序列設計干擾靶點，構建帶目的序列的慢病毒干擾載體，后續轉染質粒方法和病毒滴度檢測方法同慢病毒表達載體中的表達檢測。此干擾表達載體的構建，需根據（2）中的定位結果進行選擇合適的方法，一般RNAi只有在胞漿中才能發揮作用，而在細胞核中的無法被干擾，而目前研究的大多數lncRNA都是胞漿內的功能驗證，細胞核內目前鮮見有報道。
（4）lncRNA與miRNA的相互作用：通過在線網站預測目的lncRNA與目的miRNA之間可能的結合位點，通過對靶位點的突變，構建熒光素酶報告載體pmirGLO，將目標序列構建到fluc的3UTR區，與miRNA的mimics或NC mimics（一個是誘導劑一個是抑制劑）共轉染細胞中（如人293T細胞），設置對照組不加任何miRNA試劑和無目標序列的空載體，通過熒光值的變化來驗證是否與靶位點結合從而調控基因的表達。
（5）lncRNA與蛋白的互作驗證：通過網站來預測目的lncRNA可能互作的靶向蛋白及相關互作蛋白，或通過高通量測序結果，挖掘其中的lncRNA與mRNA的差異變化，進而篩選興趣蛋白。根據此預測或測序分析結果，構建相關質粒：lncRNA和靶蛋白的慢病毒過表達載體及干擾表達載體，分別進行細胞實驗：通過RNA pull-down實驗（lncRNA已知，靶蛋白未知，實驗對象蛋白僅通過網站預測），用T7 RNA聚合酶標記lncRNA實驗組，與抗生蛋白鏈菌素磁珠混合過夜，富集的蛋白通過SDS-PAGE進行分離，然后選擇特異性蛋白條帶進行質譜檢測，或通過RT-qPCR靶向蛋白的相對表達量，分析lncRNA對靶向蛋白的結合能力；通過RIP（RNA結合蛋白免疫沉淀）實驗（已知靶蛋白，不知lncRNA），加入靶向蛋白抗體和同型IgG抗體作為陰性對照，通過RT-qPCR靶向蛋白的表達量，分析靶向蛋白對lncRNA的結合能力；EMSA（凝膠遷移實驗）來檢測已知的蛋白和lncRNA之間的互作關系，用標記的RNA探針和靶蛋白共孵育，黨RNA-蛋白復合體形成后，用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離兩者，來確定RNA結合蛋白的特異性。在此基礎上，可通過相關蛋白的信號通路，進一步檢測其他蛋白的表達量，驗證lncRNA的表達是否會在多個蛋白間相互作用影響。
（6）lncRNA的編碼能力的驗證：構建含有肽段的lncRNA載體，即lncRNA-連接肽（如FLAG等），檢測肽段是否有表達，可驗證其是否有編碼能力。
（7）其他：通過lncRNA與mRNA的互作研究，也可通過兩者的過表達或敲低表達水平來觀察癌細胞的增殖和凋亡能力以及遷移能力，進而為疾病的診斷提供潛在的藥物靶點。
