尿喀啶干擾分析法

原理

在尿嘧啶干擾實驗中，探針是在TTP和dUTP混合物存在下用PCR擴增而產(chǎn)生，因此產(chǎn)物中的胸腺嘧啶殘基被脫氧尿嘧啶取代（羥基取代了胸腺嘧啶的5- 甲基)。尿嘧啶堿基可被尿嘧啶-N-葡萄糖基化酶特異性切割，產(chǎn)生對哌啶敏感的脫嘧啶位點。

材料與儀器

含有蛋白質(zhì)結(jié)合位點的DNA
針對結(jié)合位點兩側(cè)的互補DNA鏈上特異序列的寡核苷酸引物 2 mmol L 4種dNTP混合液 0.5 mmol L dUTP Taq聚合酶緩沖液 Taq聚合酶 TE緩沖液 pH 7. 5?8.0 尿嘧啶-N-糖基化酶 1 mol L哌啶（從10 mol L哌啶儲液稀釋） 終止 加樣染液
水浴鍋

步驟

1）用T4噬菌體多核苷酸激酶進行32P標記寡核苷酸引物的5'端設(shè)計用來進行PCR擴增的引物，使其包含蛋白質(zhì)結(jié)合位點旁側(cè)的序列，并位于兩條互補鏈上。

2) 設(shè)立2個平行的含有以下試劑的50μL PCR反應(yīng)：

5μL含有結(jié)合位點的DNA片段（0.2 pmol)

5μL 32P標記的寡核苷酸引物（20 pmol)

5μL另一條寡核苷酸引物（非標記，20 pmol)

5μL 2 mmol/L 4種dNTP 混合液

5μL 0.5 mmol/L dUTP

5μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液

19μL H2O

1μL Taq DNA 聚合酶（5 U)

在優(yōu)化的PCR擴增條件下做8個循環(huán)。

3) 用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，然后進行酚抽提及乙醇沉淀。

4) 在閃爍計數(shù)儀上測量DNA沉淀的切倫科夫計數(shù)，計算其c/min值。沉淀重懸于TE 緩沖液至約20 000 cpm/μL。

5) 用1O5 cpm的探針在50μL反應(yīng)體積中進行DNA結(jié)合反應(yīng)，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合反應(yīng)液。

6) 將膠進行放射自顯影（1?12h)，切出對應(yīng)于蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物和非結(jié)合探針的電泳帶，并將其中的DNA純化出來。將各DNA樣品重懸于25μL TE緩沖液中。

7) 建立如下尿嘧啶-N-糖基化酶反應(yīng)（50μL終體積）：

19μL H2O

5μL 1O× Tag DNA聚合酶緩沖液

25μL DNA (來自步驟6)

1μL尿嘧啶-N-糖基化酶（1 U)，37℃溫育60 min。用乙醇沉淀終止反應(yīng)。

8) DNA沉淀重懸于100μL 1 mol/L哌啶，90?95℃水浴30 min。在管子上加上一玻璃 板以防蓋子被沖開。哌啶切割之后，將管置于干冰上。

9) 在蓋子上用大注射器針頭扎孔，在真空蒸發(fā)器（如Speedvac)中凍干1 h或直至干燥。加100μL蒸餾水，再次冷凍和凍干。重復(fù)加水，冷凍和凍干。樣品進行切倫科夫計數(shù)。

10) 往沉淀中加入終止/加樣染液。95℃加熱5 min,迅速置于冰上冷卻。將非結(jié)合探針及蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合物加于6%或8%的測序膠上進行電泳及放射自顯影。