熒光金逆行性標記（上丘及外側膝狀體）

原理

在上丘和外側膝狀體進行熒光金逆行性標記存活的節細胞。這種方法常結合視神經夾傷模型使用。上丘逆行性標記可分為兩種，損傷前標記及損傷后標記。損傷前標記用于研究存活的節細胞，一般在損傷前3d進行標記。損傷后標記一般用于研究存活的纖維及再生纖維，一般在處死前3d進行標記。

材料與儀器

實驗動物
1%戊巴比妥鈉 熒光金
手術顯微鏡 顯微手術器械

步驟

(1)戊巴比妥鈉(50mg/kg體重）腹腔內注射深度麻醉動物。

(2)用顱內手術專用固定器將大鼠頭部固定。

(3)自顱頂正中線垂直切開頭皮，長約3-4cm,使用雙氧水擦拭頭皮，暴露矢狀縫和人字縫。

(4)找到Bregma點，確定雙側上丘（以Bregma點為零點，后移6.8mm,旁開1.6mm)和外側膝狀體（以Bregma點為零點，后移4.6mm和旁開3.8mm)在顱骨表面投影，造成4個直徑約1mm的骨孔，上丘深4mm,外側膝狀體深5.6mm。

(5)用牙鉆鉆開骨孔。

(6)剪開腦膜，用負壓吸引器吸取大腦皮層，暴露雙側上丘和頂蓋前區及外側膝狀體。

(7)使用微玻管戳穿腦膜。

(8)將一小塊浸有5%熒光金的明膠海綿放置于腦表面。

(9)依次縫合各層組織，做抗感染處理。

5視網膜鋪片及節細胞計數

(1)千術后相應時間點用戊巴比妥鈉過量麻醉處死動物。

(2)在眼球上做好方向的標記。

(3)立即取出眼球浸入4%多聚甲醛溶液中，沿角鞏膜緣剪除角膜，去除晶狀體和玻璃體。

(4)利用標記的方向分離視網膜并做4個切口，將視網膜分成相等的顳上、顳下、鼻上、鼻下4個象限。

(5)在4%多聚甲醛中固定40min后，用PBS(0.1mol/L,pH7.4)漂洗3次，每次5min。

(6)用小毛筆刷將視網膜平鋪于載玻片，以50%甘油PBS封片（熒光金在紫外線激發下容易淬滅，加入抗熒光衰減封片劑封片更好）。

(7)在OlympusBX5l熒光顯微鏡下，以物鏡20倍的柵格框(0.5cmx0.5mm)界定樣本區。

(8)沿每一象限中線，距視盤邊緣1、2、3mm各處各選一個樣本區，在紫外激發模式下，計數每一樣本區內熒光金標記存活的節細胞（圖4-11)。