酪蛋白測定法
原理
實驗中的氨基酸由蛋白酶從酪蛋白中水解下來。在分離出 TCA 沉淀中未分解的蛋白質后,用分光光度測定的方法對其上清液分析,氨基酸來自于酪蛋白。依據酪蛋白校準曲線,已對其量化。這個鑒定不是很敏感。
材料與儀器
酶樣品
Tris-HCl NaOH 乙酸 三氯乙酸 L-酪氨酸 酪蛋白底物
分光光度計
步驟
實驗所需「試劑」具體見「其他」
0.4 ml 酪蛋白底物被恢復到 35℃,并加入 0.2 ml 蛋白酶溶液(含 0.01 mol/L Tris-HCl,pH 8.0,10 mmol/L CaCl2)?;旌衔镌?35℃ 孵育 10 min,加入 1 ml 1.2 mol/L 的 TCA 停止反應。用同樣方法處理空白對照,不同的是在加入 TCA 之后向酪蛋白底物中加蛋白酶溶液。樣品離心 5 min,并取上清液測量其在 275nm 處的吸收值。
一個單位被定義為:35℃ 時,1 min 后,產生相當于校準曲線中 1 umol 的酪氨酸所產生的吸收值的蛋白酶量。校準曲線是用不同濃度的酪氨酸溶液繪制的。
注意事項
常見問題
試劑:
0.01 mol/L Tris-HCl,pH8.0,包含 10 mmol/L CaCl2
0.2 mol/L NaOH(Mr=40.0;0.8 g 溶于 100 ml 水中)
0.2 mol/L 乙酸(Mr=60.05;12 g 加到 1 L)
1.2 mol/L 三氯乙酸(TCA,Mr=163.4;19.6 g 溶于 100 ml 水中)
1 mmol/L L-酪氨酸(Mr=181;18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl)
酪蛋白底物:2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl2 和 0.2 mol/L NaOH,而后用 0.2 mol/L 的乙酸調 pH 至 8.0,并用 H2O 將溶液補充至 100 ml。溶液被分為等分試樣并儲存于 -20℃。