Anson 測定法
原理
血紅蛋白不是很貴,被用來做這個實驗。由于處于天然結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)通常可以抵制蛋白酶的攻擊,因此首先用尿素使血紅蛋白失活。分離非水解蛋白質(zhì)后,利用 Folin-Ciocaheau 試劑的上清液測量消化產(chǎn)物。這種試劑優(yōu)先識別色氨酸和酪氨酸,但是也可以識別半胱氨酸和組氨酸。'
實驗溫度取決于酶的專一性,為了穩(wěn)定酶的活性,溫度可從室溫(25℃)變化到 50℃。
材料與儀器
酶樣品
KH2PO4 三氯乙酸 Folin-Ciocaheau 苯酚試劑 HCl L-酪氨酸 血紅蛋白底物
分光光度計
步驟
實驗所需「試劑」具體見「其他」
1. 樣品液及空白對照的處理:
2. 校準曲線
準備 0~250 nmol L-酪氨酸的校準曲線。用 0.2 mol/L HCl 補充 0.2 mol/L L-酪氨酸(1 ul~1 nmol)的遞增量(約 12 種不同的樣品)直到 0.5 ml,并向每個樣品中加入 1 ml 0.5 mol/L NaOH 和 0.250 ml Folin-Ciocalteau 苯酚試劑(1:2 稀釋)。測量 750 nm 處對于空白對照(無酪氨酸)的吸收值變化,得到關(guān)于酪氨酸濃度增加與吸收值增加的線性曲線,直線的斜率=吸收值/nmol Tyr。
3. 計算
由于很難測定從血紅素得到的摩爾產(chǎn)物,因此定義特別的 Anson 單位如下:1 AU 指在實驗條件下,1 min 產(chǎn)生相當于千分之一的酪氨酸(1 nmol 酪氨酸約 1AU)所產(chǎn)生的著色強度的酶量。
校準曲線斜率除以 750 nm 處的吸收值等于得到產(chǎn)物量,與 nmol Tyr成正比。要得到 uAU,這個值必須被培養(yǎng)時間除(min)并且乘以因子 3,這是因為只有總實驗量 1.5 ml 中的 0.5 ml 被用來顯色反應(yīng),并且這也是可能的稀釋因子。
實驗中的酶的活力:
對于整個酶溶液,得到的這個值必須乘以整個酶溶液的量,并被實驗用的酶量和轉(zhuǎn)化 AU 的因子除。
總的酶活性:
常見問題
試劑:
1 mol/L NaOH(Mr=40.0;4 g NaOH 溶于 100 ml H2O,儲存于 PE 管中)
0.5 mol/L NaOH(1:1 的 1 mol/L NaOH 和 H2O)
1 mol/L KH2PO4(Mr=136.1;13.61 g 溶于 100 ml H2O 中)
0.3 mol/L 三氯乙酸(Mr=163.4;4.9 g 溶于 H2O 中)
Folin-Ciocaheau 苯酚試劑(可購買到,儲存于 4℃;使用前用兩倍的水稀釋)
0.2 mol/L HCl[用H2O 將 3.31 ml HCl(37%)200 ml]
1 mmol/L L-酪氨酸(Mr=181;18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl)
血紅蛋白底物:用 100 ml 的燒杯盛入 10 ml 的水,必須水浴,使溫度保持在 25℃。以下的組分,一邊攪拌一邊逐一加入 11.54 g 尿素、2.4 g 1 mol/L NaOH、0.635 g 冷凍的血紅素
攪拌 45 min 后,3.156 g 1 mol/L KH2PO4 溶解。加入水,使總重 32.6 g,并用 1 mol/L HCl 調(diào) pH 至 7.5。溶液應(yīng)該在低溫(5℃)儲存,并在 14 天內(nèi)使用。對于每一種新制備的血紅素底物,使用不同的標準曲線。