離子交換法
原理
測定肝素的方法主要有生物測定法、紫外分光光度法、化學法。肝素分子具有強負電性,能與帶正電荷的分子結合生成復合物。天青A是一種堿性染料,和肝素生成的復合物表現出“光異色現象”,即改變染料原有的吸收光譜??刂迫玖蠞舛龋趐H 8.6介質中肝素濃度低時,505 nm的光吸收與肝素濃度的關系符合朗-比爾定律。
材料與儀器
腸粘膜或豬肝
巴比妥緩沖液 阿拉伯膠 天青A 肝素
燒杯 試管 試管架 玻棒 磁力攪拌器 電爐 吸濾瓶 布氏漏斗 離心機 722分光光度計 容量瓶 真空干燥器 真空泵 水浴鍋 濾紙 布袋。精密pH試紙
步驟
溶液配制:
1. 巴比妥緩沖液(pH 8.6,0.05 mol/L):稱取1 g氫氧化鈉溶于50 ml沸水 ,再精確稱取二己基巴比妥酸5052 g溶于上述溶液中,冷卻后稀釋至500 ml,pH計校正到pH8.6。
2. 0.1%阿拉伯膠溶液:稱取0.5 g,先用少量水分散,再稀釋至500 ml,過濾備用。
3. 0.1%天青A溶液(稱取0.5 g,先用少量水在研缽中研磨溶解,再稀釋至500 ml,過濾,冰箱儲備。用時再稀釋5倍。
4. 肝素標準溶液:準確稱取一定量的肝素標準品,用滅菌水配成100 U/ ml的標準溶液,冰箱暫放 ,用時以水稀釋100倍。
操作步驟:
1.提?。}解法)
新鮮豬腸粘膜2 kg(或豬肝搗碎),加入氯化鈉80 g(4%濃度),攪拌溶解后用40%氫氧化鈉溶液調p H至9.0(用廣泛pH試紙),水浴加熱至50~55 ℃攪拌提取2 h,然后升溫至90℃保持10 min,冷卻至60 ℃用布袋過濾,取濾液待離子交換用。
2.離子交換
將濾液用水稀釋3倍,加入D254樹脂(氯型)120 g(按投料量6%,W/W),慢速攪拌6 h(可每隔1 h抽樣測定提取液中剩余肝素的含量),過濾取樹脂。
3.洗滌、洗脫
取離子交換后的樹脂先用自來水洗凈,而后用蒸餾水洗凈。取洗凈樹脂加入等體積1.4 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌1 h,過濾取樹脂。繼續用0.5倍體積的5 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌2 h,過濾收集濾液(取樣測含量)。樹脂再加入0.5倍體積的3 mol/L氯化鈉溶液,慢速攪拌1 h,過濾,濾液收集(取樣測含量)。樹脂再用0.5倍3 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌2 h,過濾,濾液收集(取樣測含量),合并三次洗脫濾液。
4.粗制肝素
取合并濾液加入1.5~2倍體積的95%乙醇洗一次,丙酮洗兩次,真空干燥即得粗品肝素。
5.精制肝素
稱取粗制肝素粉末用1%氯化鈉溶液(預冷卻)適量溶解,調pH1.8左右,離心15 min,上清液經砂心漏斗去除離心液表面的脂肪。懸液在水浴上加熱至80~90 ℃,滴加0.0003 mol/L高錳酸鉀溶液(按0.1~0.2 mol/億單位),用濾紙法檢測終點,濾液加入30%過氧化氫,調p H至11,放置36 h(冰箱內)。抽濾,濾液調pH至6.4,加入1倍體積的95%乙醇,離心,沉淀用95%乙醇洗二次,丙酮洗兩次,真空干燥即得精制肝素。
6.天青法測定效價
(1)標準曲線的制作:取較大試管(易混勻)6支,以0~5編號,按下表操作。加入阿拉伯膠后必須搖勻方可加入染料,混勻后用722型分光光度計測505 nm處吸收值,以吸收值為縱坐標,單位數為橫坐標繪制標準曲線。
(2)樣品測定:精確稱取樣品約10 mg,先配成1 mg/ml溶液,再以2個100 ml容量瓶稀釋為1 mg/100 ml溶液、2 mg/100 ml測定液,按下表操作并記錄吸收值,分別從標準曲線上查出相應單位數,按下式計算樣品效價,取平均值。
單位為U/ mg ,式中Pi 為由A 值在標準曲線上查出的單位數;V 為測定樣品的總毫升數;Vi 為測定所用樣品的毫升數;Sw 為稱取樣品的毫克數。