內皮細胞 HMEC-1 遷移實驗——transwell

簡介

Transwell 是一種實驗技術，這項技術的主要材料是 Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert）。Transwell 小室外形如同一個小杯子，杯底有通透性的膜（孔徑 0.1-12.0 μm，細胞遷移需要選擇孔徑較大的小室以便細胞穿過膜，一般用 8.0、12.0 μm）。

原理

將小室放入培養板中，小室內稱為上室，培養板內稱為下室，上下室以膜（以聚碳酸酯為例）隔開，上室內添加上層培養液，下室內添加下層培養液。將研究的細胞種在上室內，由于聚碳酸酯膜有通透性，在生長因子的誘導刺激下內皮細胞可以透過膜進行遷移。

用途

應用不同孔徑和經過不同處理的聚碳酸酯膜，可以進行共培養、細胞趨化、細胞遷移、細胞侵襲等多種方面的研究。

材料與儀器

顯微鏡、Transwell 小室、細胞培養板孔板、DMEM 和 RPMI1640 無血清培養基及完全培養基、無菌 PBS、棉簽、胰酶、甲醛固定液、0.1% 結晶紫染液。

步驟

使用 transwell 方法檢測內皮細胞遷移的步驟如下：

1、用 1% 的明膠將 transwell 小室包被，放入培養箱中孵育，30 min 后吸掉明膠，用 PBS 洗 3 次。

2、細胞處理：用無血清培養基培養內皮細胞 HMEC-1，去除血清的影響。

3、制備細胞懸液：取對數生長期的細胞，用 PBS 洗一次，加胰酶消化細胞，至拍打培養皿則浮起則表示消化完成。1 000 rpm 5 min 離心沉淀細胞并棄去上清液，加入 1 ml 無血清培養液重懸細胞，計數，調整濃度至 2×105 個/ml。

4、接種細胞：在 transwell 上室加入 100~150 μl 細胞懸液。

5、培養細胞：在 transwell 下室加 700 μl 含 20% FBS 的完全培養基，放入培養箱中培養 5 h 后拿出。

6、固定細胞：用棉簽輕輕擦去上層小室的細胞，先將 transwell 小室棄去上層液體，并置于 4% 的多聚甲醛中浸泡 15 min。

7、用 PBS 清洗 3 次小室（每次慢搖 5 min），0.1% 結晶紫室溫染色 15 min，后用 PBS 洗 3 遍；

8、將染色后的小室拿去外面的 50 ml 離心管中 PBS 中涮洗；拿棉簽沾去小室上層未穿透細胞；

9、高倍顯微鏡下進行觀察和拍照，隨機選取 5 個視野（上、下、中央、左、右各 1 個）計數呈紫色的陽性細胞，統計結果。使用 Image J 計數遷移的細胞并進行統計分析繪制柱狀圖。

注意事項

1. 鋪細胞時，上層一般鋪到 100 μl，盡量過量。

2. 最終上室應有 300 ul 體系，按調整的細胞懸液體積再加入無血清培養基補齊，同時要垂直加樣，不要有氣泡。

3. 棉簽注意可以保持棉花松軟，從而可以擦到小室邊角。

4. 水洗時間不必過長，鏡下觀察。

5. 如果進行細胞侵襲實驗，則需要在第一步進行 Matrigel 基質膠鋪板。