一種檢測(cè)阪崎腸桿菌的“一混即讀”策略
食品中致病菌的快速檢測(cè)是保障食品安全的關(guān)鍵，尤其是在嬰幼兒配方奶粉中常見(jiàn)的阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii）。傳統(tǒng)檢測(cè)方法如培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足快速檢測(cè)需求。本文提出了一種基于納米抗體（nanobody）誘導(dǎo)金納米粒子（AuNPs）聚集的比色傳感器，通過(guò)“一混即讀”的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)。
1. 納米抗體誘導(dǎo)金納米粒子聚集的機(jī)制
納米抗體具有優(yōu)異的生化特性，可特異性識(shí)別細(xì)菌表面抗原，并導(dǎo)致AuNPs聚集。在加入阪崎腸桿菌后，納米抗體與細(xì)菌結(jié)合，空間位阻抑制AuNPs進(jìn)一步聚集，從而產(chǎn)生顏色變化，使溶液從藍(lán)色恢復(fù)為紅色（圖1）。這一現(xiàn)象為“一混即讀”檢測(cè)提供了簡(jiǎn)單而靈敏的比色信號(hào)。
圖1. 基于納米體誘導(dǎo)AuNPs聚集的阪崎梭菌“混合-讀取”比色免疫傳感器的制備。
圖2展示了納米體誘導(dǎo)AuNPs聚集的表征。圖2A顯示在目標(biāo)細(xì)菌存在或不存在的情況下，納米體對(duì)AuNPs聚集的影響示意圖。2B為AuNPs溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，AuNPs溶液與含和不含坂崎菌的納米體溶液混合。不同條件下添加Nb?Es6 (E?H) TEM圖像前后AuNPs的粒徑(C)和zeta電位(D)的變化。(E) AuNPs溶液的TEM圖像。2F僅Nb?Es6存在時(shí)AuNPs溶液的TEM圖像。(G) Nb?Es6和C. sakazakii存在下AuNPs溶液的TEM圖像。2H為AuNPs溶液的TEM圖像。
圖2. 納米體誘導(dǎo)AuNPs聚集的表征。
此外，為了確定納米體誘導(dǎo)的聚集是否是一種普遍現(xiàn)象，我們測(cè)試了7種類(lèi)型的納米體，發(fā)現(xiàn)它們都能誘導(dǎo)AuNPs的聚集（圖3A）。并進(jìn)一步闡明納米體誘導(dǎo)檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs聚集的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs在pH值6 ~ 10范圍內(nèi)保持穩(wěn)定（圖3B）。在納米體存在的情況下，在pH值為6?10的范圍內(nèi)，檸檬酸覆蓋的AuNPs的顏色和光譜發(fā)生了顯著變化。如圖3C所示，當(dāng)pH值低于納米體的等電點(diǎn)（pI）時(shí)（pH值為6.93）（圖3D），由于帶正電的納米體和帶負(fù)電的檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs之間存在強(qiáng)大的靜電引力，檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的聚集和沉淀。在納米體的pI附近，由于納米體的正電荷逐漸減少，檸檬酸鹽覆蓋的AuNPs的聚集程度受到抑制。此外，當(dāng)pH值超過(guò)pI時(shí)，納米體和檸檬酸覆蓋的AuNPs都攜帶負(fù)電荷，但檸檬酸覆蓋的AuNPs聚集持續(xù)存在。因此，這表明納米體誘導(dǎo)的檸檬酸鹽端金納米顆粒聚集不僅僅涉及簡(jiǎn)單的靜電吸引。為了驗(yàn)證不同溶劑對(duì)聚集效應(yīng)的影響，研究人員首先在150 μL的AuNPs中加入10 μL PBS、純凈水和納米體（3 μg/mL），并在5 min后用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)量吸光度峰。研究結(jié)果顯示，只有納米體顯著改變了AuNPs的吸光度峰，并伴有顏色從紅色到藍(lán)色的變化（圖3E）。接著繼續(xù)探索了AuNPs與其他生物分子（包括血清蛋白和脫脂奶粉）的相互作用。作為對(duì)照，將10 μL 30 μmL納米體加入150 μL與10 μL不同濃度（3、30、300、3000 μg/mL）的BSA預(yù)混的AuNPs溶液中，觀察到當(dāng)BSA濃度低于300 μg/mL時(shí)，AuNPs溶液中有明顯的聚集現(xiàn)象。然而，隨著濃度的繼續(xù)增加，聚集作用明顯減弱，幾乎沒(méi)有觀察到聚集，AuNPs溶液呈現(xiàn)酒紅色（圖3F）。一種可能的解釋是，一些蛋白質(zhì)可以通過(guò)在AuNPs表面形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)冠狀體來(lái)阻礙納米體誘導(dǎo)的AuNPs聚集（圖3G）。為了進(jìn)一步了解納米體誘導(dǎo)AuNPs聚集的過(guò)程，我們?cè)?種AuNPs溶液中分別加入4 μL 30 μg/mL的納米體，每3分鐘在一個(gè)孔中加入10 μL 3000 μg/mL的BSA。紫外-可見(jiàn)光譜結(jié)果顯示，加入BSA后，AuNPs溶液的狀態(tài)迅速穩(wěn)定，阻止了進(jìn)一步的聚集（圖2H）。這一觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了納米體誘導(dǎo)AuNPs聚集的漸進(jìn)性質(zhì)。此外，發(fā)現(xiàn)不同濃度的納米體會(huì)影響AuNPs的聚集動(dòng)力學(xué)。AuNPs -納米體復(fù)合物的紅外光譜顯示出酰胺I波段峰的變化，從1625到1631 cm?1（圖2I）。酰胺I帶的這些變化表明，觀察到的這些蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變是它們與AuNPs相互作用的結(jié)果，對(duì)應(yīng)于C=O拉伸。
2. 高靈敏度與特異性
基于上述分析，檸檬酸末端金納米顆粒在水中分散良好，使溶液呈現(xiàn)紅色。在納米體存在的情況下，檸檬酸終止的金納米顆粒被誘導(dǎo)聚集，導(dǎo)致顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色。然而，當(dāng)納米體與不同濃度的阪坂曲菌結(jié)合時(shí)，由于細(xì)菌細(xì)胞的微米尺度，AuNPs保持自由分散，因此520 nm處的紫外吸收峰隨著細(xì)菌濃度的降低而逐漸降低（圖4B）。實(shí)驗(yàn)表明，該檢測(cè)方法肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)限為103 CFU/mL，定量檢測(cè)限可達(dá)136 CFU/mL（圖4E）。
平臺(tái)在20分鐘內(nèi)完成檢測(cè)，且對(duì)其他細(xì)菌（如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等）無(wú)交叉反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的特異性，適用于復(fù)雜樣本（圖5）。
3. 在實(shí)際樣本中的應(yīng)用
該比色傳感器成功應(yīng)用于嬰兒配方奶粉的阪崎腸桿菌檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)獲得的檢測(cè)回收率在80.3%至89.9%之間，證實(shí)了方法在復(fù)雜食品基質(zhì)中的可靠性和實(shí)用性。
總結(jié)：基于納米抗體誘導(dǎo)的AuNPs聚集技術(shù)，為快速、無(wú)標(biāo)記、經(jīng)濟(jì)的致病菌檢測(cè)提供了創(chuàng)新手段。該“一混即讀”平臺(tái)具備廣闊的食品安全檢測(cè)應(yīng)用潛力，特別適合用于便攜式現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
參考文獻(xiàn)：Chen, Pengyu, et al. "Nanobody-Induced Aggregation of Gold Nanoparticles: A Mix-and-Read Strategy for the Rapid Detection of Cronobacter sakazakii." Analytical Chemistry (2024).
