養細胞的時候，支原體怎么清除？
在養細胞的過程中，總會有一些不速來客，它們總會不請自來，比如真菌、霉菌。但最令人頭疼的還是支原體，它總是悄悄的來，對細胞造成極大的危害，今天就來認識一下支原體。
1 支原體是什么？
支原體是目前為止發現的最小的原核生物，具有以下特點：
1. 形態結構與細菌相似，但又比細菌小，是介于細菌與病毒之間的微生物；
2. 結構簡單，只有細胞膜、細胞質、核糖體、DNA、可溶性RNA和一些其它細胞內含物，支原體的細胞器只有核糖體；
3. 沒有細胞壁，具有多種形態，絲狀、球狀、扁平狀等；
4. 體積小，最小的只有0.1μm，部分支原體可通過0.22μm濾器，但過濾器并不能完全去除支原體。
2 支原體如何危害細胞？
支原體污染一般在顯微鏡下不可見，很難察覺，但細胞會受到極大的損傷，主要通過以下途徑影響細胞生長及功能。
3 支原體來自哪里？
1. 污染細胞支原體的種類
污染細胞的種類有在二十種以上，其中95%以上的支原體污染是口腔支原體、精氨酸支原體、發酵支原體、萊氏無膽甾原體和豬鼻支原體五種。
2. 支原體污染的來源
a. 環境污染：如細胞培養房、細胞培養箱、超凈工作臺內已被支原體污染；
b. 實驗器材的污染：移液槍、移液管、細胞培養皿、水浴鍋等；
c. 細胞培養試劑的污染：培養基、胰酶、血清、細胞凍存液等；
d. 污染的原代細胞；
e. 操作人員操作帶來的污染等；
3 如何預防支原體？
支原體危害這么大，我們應該如何應對？我們可以從以下幾個方面預防支原體：
1. 定期消毒：定期對細胞房、實驗服、移液槍、細胞培養箱等進行消毒，及時清除支原體；
2. 檢查細胞培養試劑：選擇來源可靠的試劑及耗材產品，在進行細胞培養操作之前，檢查細胞培養基、血清、胰酶等試劑，可選擇合適孔徑的濾膜進行過濾除菌，使用過程中如發現有污染應及時更換；
3. 規范細胞培養操作：建立良好的細胞培養操作SOP，遵循無菌操作原則，規范穿戴實驗服、口罩、手套等，并在細胞培養開始時進行消毒；規范處理實驗廢棄物；
4. 在培養基中加入支原體預防試劑：
加入抑制支原體DNA合成的抗生素：例如氟喹諾酮類抗生素；
加入抑制支原體蛋白質合成的抗生素：例如大環內酯類、四環素、雙萜烯類等抗生素；
加入非抗生素類支原體清除試劑：如膜活性多肽，通過與支原體膜特異性結合徹底清除支原體。
4 支原體檢測方法有哪些？
1.分離培養法：
檢測方法：將待檢樣品接種到適合支原體生長的液體培養基或固體培養基中，如有支原體污染，液體培養基顏色會改變，固體培養基將會有菌落瘋狂生長。
優點：該方法被稱為支原體培養法的金標準，可以檢測絕大多數支原體。
缺點：支原體生長到一定數量才能判斷是否有污染，檢測時間長，無法實現對支原體的快速檢測
2.原位染色法：
檢測方法：通過染色試劑（如DAPI、Hoechst 等）對待測細胞培養物進行染色，在熒光顯微鏡下觀察待測樣品的熒光判斷支原體污染。
優點：可清晰直觀的看到支原體微粒。
缺點：死亡細胞釋放的DNA也會被染色，在支原體輕度污染時，較難判斷是否有支原體污染。
3.化學發光法
檢測方法：利用支原體特有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發光反應進行檢測，通過比較檢測試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。
優點：檢測快速，僅需15min即可完成檢測。
缺點：該方法只能檢測活的支原體，如果支原體死亡，將無法通過ATP的變化判斷支原體污染。
4.巢式PCR法：
檢測方法：通過設計兩對引物擴增支原體的DNA，第一對引物用于第一步PCR，用于初步判斷是否有支原體污染；用第二對引物進行第二輪PCR，觀察DNA條帶用于鑒定是否有支原體污染。
優點: 通過兩輪PCR可以大大提高檢測的特異性和靈敏度，可根據擴增片段的大小大致預測支原體的種屬。
缺點：操作繁瑣，需要進行兩輪PCR。
5.探針法qPCR：
檢測方法：設計特異性引物和熒光探針，通過探針法qPCR高靈敏檢測培養的細胞等生物材料中是否有支原體污染。
優點：靈敏度高，檢測快速，可一次性檢測大量樣品，PCR擴增后無需電泳分析即可判斷是否具有支原體污染。
缺點：該方法靈敏度很高，因此對實驗環境要求較為苛刻，且需要精密的qPCR儀器。
6.等溫擴增變色法：
檢測方法：通過設計4-6對特異性引物，在一定的恒定溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物進行核酸的快速擴增，并且通過顏色變化而無需電泳分析即可確定是否有支原體污染。
優點：不需要反復的升溫和降溫，不需要精密的儀器，在恒定的溫度下即可對核酸進行擴增。反應結束后，無需電泳分析，通過顏色變化即可判斷是否具有支原體污染。
缺點：對引物要求較高，需要設計多對引物，且擴增產物不能用于測序。
5 細胞被污染，怎么辦？
如果細胞被支原體污染，不要著急，也不要棄掉，我們可以及時清除支原體，對細胞進行挽救，減少支原體對細胞的危害。
1.及時更換培養液：可以減緩支原體的污染，但不能完全清除；
2.使用抗生素類去除試劑：抗生素對支原體有較好的抑制作用，可以有效清除支原體，但長時間使用抗生素，會產生耐藥性的風險。在使用單一抗生素清除效果不佳時，可以考慮更換抗生素或者采用復合型抗生素試劑；
3.使用非抗生素去除試劑：非抗生素清除試劑不會產生耐藥性，對支原體的清除效果可以達到100%，且幾乎對細胞沒有影響，是去除支原體的首選試劑。
4.實驗室環境清潔：發生支原體污染后，應及時處理已被污染的細胞，并對細胞房進行徹底的清潔和消殺，防止交叉污染。
細胞培養過程中細菌和真菌污染其實也是很令人頭疼的事情。除了在培養液中添加一定比例的抗生素外，也建議大家定期對細胞房、培養箱進行清潔除菌。
實驗過程中，我們的細胞很珍貴，實驗試劑也屬實不便宜呢，雖說我們現在已經擁有了各種各樣的支原體清除和除菌劑產品，但是避免污染的最好方式還是注意實驗規范以及定期清潔，為了不給細菌、真菌、支原體卷土重來的機會，最好同時把實驗環境中的污染源也一起消滅，最后希望大家的實驗都順順利利，遠離污染。
