蛋白質的定量測定方法
【 實驗目的 】
1.學習Folin-酚 試劑 法測定蛋白質含量的原理。
2.掌握Folin-酚 試劑 法測定蛋白質含量的方法和操作。
【 實驗原理 】
蛋白質中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與Folin-酚試劑起氧化還原反應。反應過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中，蛋白質分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu 2+ 作用生成蛋白質-Cu 2+ 復合物；第二步：蛋白質-Cu 2+ 復合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍色的化合物。該呈色反應在30分鐘內即接近極限，并且在一定濃度范圍內，藍色的深淺度與蛋白質濃度呈線性關系，故可用比色的方法確定蛋白質的含量。進行測定時要根據(jù)蛋白質濃度的不同選用不同的測定波長：若蛋白質含量高時（25-100μg）在500nm波長處進行測定，含量低時(5-25μg)在755nm波長處進行測定。最后根據(jù)預先繪制的標準曲線求出未知樣品中蛋白質的含量。
Folin-酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中蛋白質含量高于5μg即可測得，是測定蛋白質含量應用得最廣泛的方法之一。
【 實驗材料 】
1.實驗器材
100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度計。
2.實驗試劑
(1) Fo1in-酚試劑甲：將lg碳酸鈉溶于50ml 0.lmol／L氫氧化鈉溶液中，再把0.5g硫酸銅(CuSO 4 ·5H 2 O)溶于100m1 1％酒石酸鉀(或酒石酸鈉)溶液，然后將前者50ml與后者lml混合。混合后1日內使用有效。
(2)Folin-酚試劑乙：在1.5L容積的磨口回流瓶中加入100g鎢酸鈉(Na 2 WO 4 ·2H 2 O)、25g鉬酸鈉(Na 2 MoO 4 ·2H 2 O)、700ml蒸餾水、50ml 85％磷酸及100ml濃鹽酸，充分混勻后回流10h。回流完畢，再加150g硫酸鋰、50ml蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅除過量的溴，冷卻后定容到1000ml。過濾，如顯綠色，可加溴水數(shù)滴使氧化至溶液呈淡黃色。置于棕色瓶中暗處保存。使用前用標準氫氧化鈉溶液滴定，酚酞為指示劑，以標定該試劑的酸度，一般為2mol／L左右(由于濾液為淺黃色，滴定時濾液需稀釋100倍，以免影響滴定終點的觀察)。使用時適當稀釋(約1倍)，使最后濃度為lmol／L酸。
(3)標準蛋白質溶液：用分析天平精密稱取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸餾水完全溶解后，轉移至100毫升容量瓶中，準確稀釋至刻度，使蛋白質濃度1mg/ml。
(4)樣品溶液：配制約0.5mg/ml的酪蛋白溶液作為未知樣品溶液。
【 實驗操作 】
1. 繪制標準曲線
取7支 試管 ，按下表分別加入各試劑
試劑 管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
標準蛋白質溶液(ml) | 0.0 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 0.6 |
蒸餾水(ml) | 1.0 | 0.9 | 0.8 | 0.7 | 0.6 | 0.5 | 0.4 |
Fo1in-酚試劑甲(ml) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
搖勻，室溫下放置10分鐘
Fo1in-酚試劑乙(ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
各管加入Fo1in-酚試劑乙后，立即搖勻，放置30分鐘后比色，在500nm處記下各管光密度，以0號管為對照，以光密度為縱坐標，標準蛋白質溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
2. 測定未知樣品：取2支 試管 ，分別準確吸取1毫升樣品溶液，各加5毫升Fo1in-酚試劑甲，搖勻，室溫放置10分鐘后，再各加1毫升Fo1in-酚試劑乙，立即搖勻，放置30分鐘，在500nm處測定光密度值。
【 實驗結果 】
根據(jù)未知樣品溶液的光密度值，在繪制好的標準曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質含量。
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