雙向瓊脂糖凝膠電泳實驗
【實驗目的】
了解和掌握雙向電泳技術，并學習用它來研究與DNA 復制相關的問題。
【實驗原理】
DNA 分子有線狀的，還有一些非線狀的，如復制叉和重組DNA 結構。雙向瓊脂糖凝膠電泳技術就是被人們開發(fā)用以研究一些非線狀DNA 分子的。雙向瓊脂糖凝膠電泳技術(2-D gel)實際上可分為兩類：中性/中性雙向凝膠電泳和中性/堿性雙向凝膠電泳技術。它們的工作原理如下：
中性/中性雙向凝膠電泳：非線狀的DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的泳動行為和線狀DNA 分子相比是不規(guī)則的。并且這種行為隨著瓊脂糖濃度或電壓增加而加劇。而這正是中性/中性雙向凝膠電泳的工作原理：在第一向中，樣品在瓊脂糖凝膠中以低瓊脂糖濃度、低電壓的條件進行電泳，則DNA 分子主要根據(jù)其分子量大小被分離。在第二向中，則采用高濃度瓊脂糖凝膠和較高電壓條件，DNA 分子的分離則主要根據(jù)其形狀。
中性/堿性雙向凝膠電泳：此方法適合用來分析DNA 復制中間體。這些中間體包括各種長度的新鏈部分。在第一向中與中性/中性雙向凝膠電泳一樣采用中性pH，將DNA分子按其分子量大小分開。在第二向中，采用堿性pH，使DNA 復制中間體中新鏈部分釋放，并按其長度分離，如同在普通瓊脂糖凝膠中一樣。
雙向凝膠電泳在分析DNA 結構方面，最大的特點就是簡便易行。它已成功地應用于酵母DNA 復制起點的定位、確定酵母復制叉阻抑點以及DNA 復制抑制劑機理的研究等。但雙向電泳也有一定的問題，如得到的圖像與理論上的圖像不吻合，而且很難解釋。如果電泳條件不當，還會產(chǎn)生假象。本實驗所介紹的實驗步驟適用于分析3kb～5 kb的復制型的DNA 限制性片段。
【 儀器 、材料與 試劑 】
1.瓊脂糖粉(Ⅱ型，MediumEEO，Sigma)。
2.TBE 貯存液(450mmol/L Tris-硼酸鹽，10mmol/L EDTA)：1L 體積，54g Tris 堿(Fluka)，27.5g 硼酸(Fluka)，20mL 0.5mmol/LEDTA(pH8.0；Serva)，室溫保存。
3.6×加樣緩沖液：0.25%溴酚藍(Bio-Rad)0.25%，二甲苯青FF(Bio-Rad)，15%的Ficoll(400 型，pHarmacia)溶于水中，室溫保存。
4.堿性緩沖液(40mmol/L NaOH 和1mmol/L EDTA)：1L 體積，8mL 5mol/LNaOH(Fluka)，2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0，Serva)，需新鮮配制。
5.EB 貯存液(10mg/mL)：1g EB(Sigma)，100mL 去離子水，避光容器4℃保存。
【實驗步驟】
中性/中性雙向凝膠電泳
第一向電泳：(低瓊脂糖濃度和低電壓)
1.用膠帶封好一個膠模，將其放在一個水平的臺面上(最好用水平儀檢測過)。放入樣品梳(梳齒底部與玻璃板之間距離為2mm)。
2.取適量的瓊脂糖粉末和TBE 電泳緩沖液(0.4%瓊脂糖，45mmol/Ltris-硼酸鹽和1mmol/L 的EDTA)配制凝膠，加熱時不時地輕搖玻璃瓶或錐形瓶，確保瓊脂糖全部溶解。
3.冷卻該溶液至60℃，然后倒入膠模中，讓其在室溫下靜置凝固30min～1h。完全凝固后小心移去梳子和膠帶，把膠板移至電泳槽內。
4.向電泳槽內注入相同的TBE 緩沖液(45mmol/Ltris-硼酸鹽，1mmol/L 的EDTA)直至緩沖液剛好沒過凝膠面。
5.取一定量的DNA 樣品與6×上樣緩沖液混合，注入緩沖液中加樣孔內。蓋上電泳槽，把電源連在電極上，讓DNA 向正極泳動，電壓為1V/cm(由兩電極之間的距離測定)。
6.電泳24h 后，取出膠板。用TBE 緩沖液和0.3μg/mL EB 貯存液配成的染液染色。
7.紫外光下顯色，并切下含有DNA 樣品的膠帶。
第二向電泳：(高瓊脂糖濃度、高電壓)
8.準備另外一個膠模，但不帶梳子。把模子放在一個水平臺面上(最好用水平儀檢測過)，操作要在4℃冷室內進行。
9.制備好含有EB 的TBE 緩沖液(0.3μg/mL EB，45mmol/L Tris-硼酸鹽，lmmol/LEDTA)并冷卻至4℃。
10.按第一向電泳的方法，配制瓊脂糖凝膠，只不過瓊脂糖濃度為1.0%。
11.冷卻瓊脂糖凝膠溶液至約70℃，加入EB 至濃度為0.3μg/mL。
12.把第一向電泳中切下的樣品凝膠帶水平放置在第二個膠板的頂端，然后倒入含有1.0%瓊脂糖凝膠溶液，并使之凝固(都在4℃下進行)。
13.移去膠帶，并把膠板放到電泳槽內，向槽內注入冷卻至4℃的含有0.3μg/mL EB的TBE 緩沖液，使緩沖液超過膠面約1mm。放置循環(huán)水泵的導管于電泳槽兩極間緩沖液內，使電泳液在兩極間循環(huán)。
14.蓋上電泳槽并接好電源。DNA將向正極泳動。電壓4V/cm，4℃下電泳14h，電泳結束后，將膠板從電泳槽內取出。如果DNA樣品已被標記(如32P)可直接進行放射自顯影。若樣品沒有被標記，可采用雜交的方法。放射自顯影可在室溫下進行，也可在-70℃下用增敏屏進行曝光。沒有標記的樣品可用Southern-雜交或堿性轉移法將樣品DNA轉至尼龍膜上，用同位素標記探針雜交而進行檢測。
中性/堿雙向電泳
第一向電泳：中性/堿性雙向電泳的第一向同中性/中性雙向電泳的第一向電泳步驟幾乎完全相同。
第二向電泳：(0.8%瓊脂糖，NaOH-EDTA 緩沖液，電壓1V/cm)
1.制備一個膠模不帶梳子，并把它放于4℃冷室內的水平臺面上(最好用水平儀測過)。
2.配制NaOH-EDTA 緩沖液(40mmol/L NaOH，1mmol/L EDTA)冷卻到4℃。
3.把從第一向電泳中切下的樣品帶置于堿性緩沖液中，室溫下平衡至少30min。之后將平衡好的樣品帶平行放置在膠模的一端，溫度為4℃。
4.配制 瓊脂 糖凝膠，濃度為0.8%。
5.將 瓊脂 糖溶液冷卻至60℃后，加入NaOH 和 EDTA 至濃度分別為40mmol/L 和1mmol/L，將配好的膠液倒入模子中，讓樣品帶和膠在4℃下靜置凝固。
6.去掉膠模上的膠帶，把膠板放入電泳槽內。加入堿性緩沖液至超過膠面約1mm。把循環(huán)水泵導管置于兩極間緩沖液中，并使緩沖液在電泳槽中循環(huán)。
7.蓋上電泳槽，連好電源。DNA 分子將向正極泳動(紅色接線柱)。電壓1V/cm，4℃下至少24h。
8.中性/堿性雙向電泳的樣品檢測基本相同于中性/中性雙向電泳的方法。
【注意事項】
1.DNA 片段的大小對雙向電泳條件的選擇是一個關鍵因素，本實驗所用例子為3kb～5kb。如果DNA 片段超過5kb，雙向電泳的條件需要相應地改變。
2.加樣量也是一個關鍵步驟，理想的加樣量是300ng～1000ng。
3.第一向電泳中，凝膠的長度應至少達到25cm，才能保證更好地分離。0.4%的瓊脂糖凝膠比較脆，取梳子時要格外小心。
4.TBE 濃度最初采用90mmol/L Tris-硼酸鹽和2mmol/L EDTA 。但現(xiàn)在通常所用的濃度僅為其一半即可提供所需緩沖能力。
5.在整個中性/中性雙向電泳過程中，要使用同一批TBE 貯存液，以保證相同的離子強度和pH。
6.在雙向電泳過程中，可在樣品一端加合適的DNA 分子量標記物，幫助分析樣品的大小和位置。在第一、第二向中，該標記物都起重要作用，尤其是在第二向中，作用更大。
來源：實用分子生物學實驗指南
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