病毒衣殼裝配和核酸包裝機(jī)制的研究進(jìn)展
關(guān)鍵詞： 病毒衣殼裝配 核酸包裝 機(jī)制
病毒是目前所知最簡(jiǎn)單的生命單位，只有核酸和蛋白 質(zhì)組成。病毒衣殼裝配和核酸包裝機(jī)制的研究對(duì)病毒復(fù)制、病毒病防治和闡明生命活動(dòng)的基本規(guī)律具有重要意義。分子病毒學(xué)的研究成果促進(jìn)了病毒衣殼裝配和核酸包裝機(jī)制的研究，近幾年有關(guān)病毒裝配和核酸的包裝機(jī)制研究取得了較大的進(jìn)展。本文就病毒衣殼的裝配途徑、裝配原理、核酸包裝機(jī)制和包裝信號(hào)序列等綜述如下。
1 病毒衣殼裝配途徑
病毒顆粒主要由核酸和蛋白 質(zhì)組成，核心為病毒基因組，為病毒增殖和遺傳變異提供遺傳信息。衣殼可保護(hù)病毒核酸免受外界因素影響破壞，并可介導(dǎo)病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，衣殼是病毒的主要抗原成份，是研制病毒蛋白 疫苗的主要靶位。病毒衣殼是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白 裝配形成的，病毒主要衣殼蛋白 具有自身裝配成病毒樣顆粒的特性(virus-like particle, VLP)，即無(wú)有核酸的病毒空衣殼。有些病毒可能還需病毒編碼的骨架蛋白 (scaffolding protein)輔助，這些病毒衣殼被稱為原頭(prohead)、原殼(procapsid)或病毒樣顆粒(Virus-like particle, VLP)
［1］。噬菌體衣殼裝配首先由12個(gè)孔道蛋白 gpI聚合成玫瑰形的十二聚體頂角，此頂角為病毒核酸包裝和感染細(xì)菌過(guò)程中核酸出入的通道
［2］。在皰疹病毒感染的細(xì)胞內(nèi)有三種衣殼：A型衣殼為一空殼，不含病毒核酸及內(nèi)部結(jié)構(gòu)；B型衣殼又稱中間型衣殼，不含病毒核酸，但在病毒外殼內(nèi)還有一蛋白 質(zhì)層；C型顆粒為完整的病毒顆粒。B型衣殼是A、C型的前體，B型衣殼的蛋白 質(zhì)層為骨架蛋白 ，由VP21、VP22a組成，在A型和C型中消失。病毒衣殼中主要衣殼蛋白 VP5約占70%，其余衣殼蛋白 VP19c、VP23、VP26約占30%，僅有這4種衣殼蛋白 還不能形成病毒衣殼，只能形成異型多聚體。只有在骨架蛋白 輔助下方可形成HSV B型衣殼。HSV病毒衣殼裝配可分為以下幾步：
(1)病毒主要衣殼蛋白 (VP5)與蛋白 酶(VP24)前-VP21及前-VP22a共價(jià)形成小分子復(fù)合物，在附件蛋白 (VP19c、VP23)輔助下逐漸形成部分衣殼和完整的B型衣殼。VP5形成HSV-1的衣殼主要部分，前-VP21和前VP22a為骨架蛋白 ，形成衣殼內(nèi)部蛋白 質(zhì)層。蛋白 酶VP24在兩層之間發(fā)揮橋梁作用。
(2)VP24水解前-VP21和前-VP22a，改變了骨架蛋白 的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，VP24與前-VP21分離而與VP5共價(jià)結(jié)合附著在衣殼上面，VP21與VP22a形成縮小的骨架蛋白 層。
(3)HSV DNA通過(guò)末知機(jī)制進(jìn)入B型衣殼伴隨VP21、VP22a出殼，衣殼蛋白 構(gòu)象變化、結(jié)構(gòu)亞基重排形成為成熟C型顆粒。如果病毒DNA包裝失敗，骨架蛋白 出殼或降解，而VP24與VP5共價(jià)連接形成A型衣殼。HSV衣殼經(jīng)GuHcl處理后，病毒DNA以細(xì)條帶形式從衣殼頂角處出殼［3］。因此認(rèn)為HSV衣殼五鄰體頂角為病毒DNA出入衣殼的位置，GuCl處理導(dǎo)致五鄰體短暫開(kāi)放，DNA出殼后再恢復(fù)原始狀態(tài)［4］。
2 病毒衣殼裝配的幾何原理
60年代初，Kaspar和Klug等提出用準(zhǔn)等構(gòu)理論(theory of quasiequivalence)解釋大量病毒蛋白 亞基組成球狀病毒20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)的機(jī)理。根據(jù)這一理論，所有結(jié)構(gòu)蛋白 亞基在組成球狀殼體的排列，并不嚴(yán)格按照球狀所要求的嚴(yán)格等構(gòu)方式，而是由亞基之間連接發(fā)生一些畸變，從而導(dǎo)致了輕微的不對(duì)稱，這樣大量結(jié)構(gòu)蛋白 亞基只有根據(jù)20面體立體對(duì)稱，形成一個(gè)等距球體。衣殼應(yīng)有20個(gè)面，12個(gè)頂角，30條邊，且有5、3、2三種對(duì)稱軸，蛋白 亞基具有相同的構(gòu)象，衣殼由五鄰體和六鄰體構(gòu)成，只能有12個(gè)五鄰體，六鄰體的數(shù)目為10的倍數(shù)［6］。然而還有一些病毒為非準(zhǔn)等構(gòu)理論結(jié)構(gòu)，如乳多空病毒衣殼由72個(gè)殼粒組成，全部為五鄰體，其中有12個(gè)五價(jià)五鄰體和60個(gè)六價(jià)五鄰體。電鏡研究表明病毒結(jié)構(gòu)蛋白 可存在幾種不同的構(gòu)象，如P22噬菌體衣殼蛋白 gp5有7種構(gòu)象、SV40的VP1共有六種構(gòu)象。因而B(niǎo)erger等于1993年提出局部法則理論［7］(local rule-based theory)認(rèn)為病毒結(jié)構(gòu)蛋白 亞基可具有幾種不同構(gòu)象，蛋白 亞基構(gòu)象間的特異識(shí)別及聚合形成病毒衣殼裝配的動(dòng)力，進(jìn)而形成一個(gè)閉合的衣殼。若在蛋白 亞基裝配過(guò)程中有一次構(gòu)象識(shí)別錯(cuò)誤，則導(dǎo)致衣殼形成不能閉合的螺旋狀結(jié)構(gòu)。病毒的空心衣殼與成熟的病毒顆粒衣殼結(jié)構(gòu)還有一些顯著差別。病毒空心衣殼結(jié)構(gòu)疏松，沿衣殼的5、3、2對(duì)稱軸上有貫穿衣殼的裂孔。當(dāng)病毒DNA包裝完成以后，病毒衣殼變得致密，裂孔關(guān)閉，至少在衣殼內(nèi)2/3處關(guān)閉。伴隨病毒核酸包裝，病毒衣殼膨脹，衣殼蛋白 構(gòu)象可發(fā)生變化［8］。如噬菌體HK97為20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，衣殼由415主要結(jié)構(gòu)蛋白 構(gòu)成，衣殼蛋白 亞基分子量為42KDa，無(wú)骨架蛋白 ，在病毒衣殼裝配過(guò)程中可出現(xiàn)4種衣殼演變形成：
①proheadⅠ：由415個(gè)42KDa的結(jié)構(gòu)蛋白 亞基構(gòu)成，衣殼蛋白 之間無(wú)酶解、共價(jià)交聯(lián)和構(gòu)象變化，易被離解為多個(gè)殼粒。②proheadⅡ：衣殼大小不變，由于衣殼蛋白 氨基端被水解而變?yōu)?1KDa，所以衣殼內(nèi)層密度變?nèi)酢?/span>
③HeadⅠ：病毒核包裝，衣殼膨脹，厚度變小，成為多角體，殼粒結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，各結(jié)構(gòu)蛋白 亞基之間發(fā)生交聯(lián)。④HeadⅡ：酶解后的31KDa衣殼蛋白 亞基之間以共價(jià)鍵交聯(lián)，形成5、6個(gè)或多個(gè)蛋白 亞基形成的寡聚體，衣殼蛋白 構(gòu)象發(fā)生變化，各亞基之間重排形成牢固的20面體立體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。
3 病毒核酸包裝機(jī)制
病毒核酸包裝可能有兩種包裝機(jī)制，一種以乳多空病毒為代表，病毒基組與細(xì)胞組蛋白 首先形成微型染色體，然后病毒結(jié)構(gòu)蛋白 以病毒微型染色體為支架，不同構(gòu)象的蛋白 亞基之間特異識(shí)別與聚體逐漸裝配形成封閉的病毒顆粒，核酸包埋其中，似“作繭自縛”。但在無(wú)病毒DNA時(shí)，衣殼蛋白 仍可裝配病毒樣顆粒(VLP)，表明病毒衣殼裝配是不必依賴于其DNA為支架的［9］。另一種以噬菌體、腺病毒、皰疹病毒為代表，其機(jī)制為病毒結(jié)構(gòu)蛋白 在細(xì)胞內(nèi)預(yù)先形成衣殼，然后病毒DNA被特異識(shí)別并包裝進(jìn)入衣殼，形成完整的病毒顆粒。這類(lèi)病毒DNA復(fù)制時(shí)，病毒基因組可從多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)開(kāi)始，一個(gè)復(fù)制周期完成之前，下一個(gè)復(fù)制周期已開(kāi)始形成基因組首尾相接的串聯(lián)體(Concatamer)，病毒以串聯(lián)體為底物，由病毒編碼的包裝酶(package enzyme)或未端酶(Terminase)將病毒基因組從串聯(lián)體上包裝起始點(diǎn)特異切割(首次切割)，當(dāng)一個(gè)單位的病毒基因組從孔道蛋白 或五鄰體進(jìn)入并充滿衣殼后，由Head機(jī)制啟動(dòng)末端切割，從而完成病毒DNA包裝。而某些病毒DNA復(fù)制結(jié)束后，就形成一個(gè)完整的基因組，如腺病毒DNA5′端共價(jià)連接DNA結(jié)合蛋白 TBP，在包裝過(guò)程中不需對(duì)DNA切割［10］。
病毒包裝酶是由病毒基因編碼，分為大小兩個(gè)亞基，大亞基可特異結(jié)合病毒衣殼頂角處的孔道蛋白 、金屬離子及ATP。小亞基可特異識(shí)別與結(jié)合病毒核酸及ATP。包裝酶都具有保守的ATP結(jié)合框架，因而具有ATP酶活性。在DNA包裝過(guò)程中，每包裝兩個(gè)堿基對(duì)則需消耗一個(gè)ATP。依據(jù)包裝酶對(duì)DNA切割的特異性不同又可分為三種類(lèi)型：第一類(lèi)為特異的首末次切割，因而病毒衣殼中核酸具有相同的長(zhǎng)度，如SV40、T3、T7噬菌體。第二類(lèi)為在病毒DNA特定區(qū)域發(fā)生非序列特異性切割，如T1、P2、P22、SPP噬菌體，病毒衣殼中核酸長(zhǎng)度有輕微差異。第三類(lèi)為完全非特異性切割，如T-even, 因而衣殼中的核酸是隨機(jī)的［11］。最近研究發(fā)現(xiàn)噬菌體Φ29包裝機(jī)制與其它噬菌體又有不同：在其DNA包裝過(guò)程中還需一病毒DNA5′端編碼的一小段RNA被稱為包裝RNA(pRNA)。pRNA5′和3′端在DNA包裝過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。pRNA一端可結(jié)合于P22孔道蛋白 上，另一端則以短暫互補(bǔ)方式結(jié)合于病毒基因組5′端。病毒核酸進(jìn)入衣殼的方式有以下幾種學(xué)說(shuō)：包裝酶與孔道蛋白 形成滲透壓泵模型、可轉(zhuǎn)動(dòng)螺紋模型、捕捉臂模型、搬手模型等。病毒DNA進(jìn)入衣殼后其體積將是包裝前的1/30～1%。
4 病毒基因組包裝的信號(hào)序列
病毒核酸包裝是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，是蛋白 質(zhì)與蛋白 質(zhì)及蛋白 質(zhì)與核酸之間的復(fù)雜作用引起的。病毒結(jié)構(gòu)蛋白 或病毒包裝酶識(shí)別病毒核酸，并從細(xì)胞大量DNA中特異選擇包裝病毒DNA，其機(jī)制目前尚不十分清楚。但大量研究表明在病毒基因組上游調(diào)節(jié)區(qū)或編碼包裝酶的基因中有一核酸包裝信號(hào)序列，稱為包裝序列(Pac序列)。某些病毒pac序列包括包裝酶特異識(shí)別與切割兩個(gè)部分。包裝序列可與包裝酶或衣殼結(jié)構(gòu)蛋白 發(fā)生特異識(shí)別。目前研究較為深入的有噬菌體、腺病毒、皰疹病毒、SV40等。噬菌體pac包裝序列包括三部分，cosN、cosQ、cosB。包裝酶gpA、gpNUI可在串聯(lián)體上cosN位點(diǎn)處特異切割形成粘末端，cosN為包裝酶特異切割位點(diǎn)，cosB為包裝酶特異識(shí)別結(jié)合點(diǎn)位，cosQ為基因組包裝完成以后末端切割位點(diǎn)。只有包裝酶在N1和N2兩點(diǎn)切割形成12個(gè)堿基末端方可被特異包裝。其它切割形式因不穩(wěn)定而降解［13］。腺病毒包裝信號(hào)序列位于反向重復(fù)序列ITR與EIA之間的230～380核苷酸內(nèi)，有一系列AT重復(fù)序列組成，至少需3個(gè)AT重復(fù)序列參與DNA包裝。SV40的包裝信號(hào)序列為位于SV40 DNA復(fù)制起始位點(diǎn)ori附近的六個(gè)GC盒組成的ses結(jié)構(gòu)。GC盒數(shù)目、位置及與ori距離都可影響SV40包裝效率。SV40衣殼還可選擇性包裝SV40 ses結(jié)構(gòu)攜帶的外源基因，并將外源基因?qū)隨V40敏感的靶細(xì)胞核內(nèi)［14］。HBV病毒復(fù)制具有逆轉(zhuǎn)錄病毒特性，HBV轉(zhuǎn)錄的前基因組Pg RNA被HBV衣殼蛋白 選擇包裝主要是由Pg RNA近5′端一段順式元件介導(dǎo)的，稱為E元件。E元件決定Pg RNA被特異選擇包裝。HBV衣殼蛋白 可特異包裝E元件所攜帶的一大段外源基因。由于pac元件由大量重復(fù)序列組成且包含很多順式反應(yīng)元件，那么pac元件所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其相應(yīng)的反式作用因子對(duì)病毒核酸包裝的影響目前尚不清楚。病毒裝配機(jī)制的研究對(duì)病毒性疾病的防治具有重要意義。由于病毒衣殼可特異包裝pac元件所攜帶外源基因，人們可借助病毒的組織親嗜性，用衣殼蛋白 將目的基因特異包裝并運(yùn)送到特異靶細(xì)胞，可為人類(lèi)基因治療提供理想的載體。由于病毒結(jié)構(gòu)蛋白 亞基上有病毒裝配的非關(guān)鍵區(qū)域，可將外源表位上插入此處，而不影響病毒顆粒裝配，人們可借助此開(kāi)發(fā)攜帶多種外源基因的嵌合病毒樣顆粒疫苗。
本文受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：3970038)
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