聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）分離蛋白質
【實驗目的】
1. 了解和掌握聚丙烯酰胺 凝膠電泳的技術和原理；
2. 掌握用此法分離蛋白質組 分的操作方法。
【實驗原理】
在生物化學、分子生物學和基因（遺傳）工程實驗中，常常要進行蛋白質和核酸的分離工作。聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質進行蛋白質或核酸分離的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱ACR）和交聯劑N，N-甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 簡稱BIS）在催化劑的作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。通過改變單體濃度與交聯劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠，用于分離分子量大小不同的物質。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：
（1）化學聚合：催化劑采用過硫酸銨，加速劑為N,N,N,N－四甲基乙二胺（簡稱TEMED）。通常控制這二種溶液的用量，使聚合在1小時內完成。
（2）光聚合：通常用核黃素為催化劑，通過控制光照時間、強度控制聚合時間，也可加入TEMED加速反應。
聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為連續的凝膠（僅有分離膠）電泳；第二類為不連續的凝膠（濃縮膠和分離膠）電泳。
一般地，不連續聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應：①電荷效應（電泳物所帶電荷的差異性）； ②凝膠的分子篩效應（凝膠的網狀結構及電泳物的大小形狀不同所致）。③濃縮效應（濃縮膠與分離膠中聚丙烯酰胺的濃度及pH的不同，即不連續性所致）。因此，樣品分離效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，簡稱SDS）是陰離子表面活性劑，它能以一定比例和蛋白質結合，形成一種SDS-蛋白質復合物。這時，蛋白質即帶有大量的負電荷，并遠遠超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質分子間的電荷差別降低仍至消除。與此同時，蛋白質在SDS作用下結構變得松散，形狀趨于一致，所以各種SDS-蛋白質復合物在電泳時產生的電泳遷移率的差異，僅僅取決于蛋白質的分子量。另外，SDS-蛋白質復合物在強還原劑 （巰基乙醇）存在下，蛋白質分子內二硫鍵被打開，這樣分離出的譜帶即為蛋白質亞基。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數。
本實驗采用化學聚合法制膠，進行不連續的凝膠電泳，并用考馬斯亮藍快速染色，以分離和鑒定大腸桿菌菌體、發酵液中和純化的蛋白產物。
【試劑與器材】
（一）試劑（(全班分兩大組，每組配一份，如1－5組一份，6－10組一份)
（1）30% 的凝膠貯備液：ACR 30g + Bis 0.8g 溶于 100 mL去離子水中，用3號新華濾紙過濾至棕色瓶中，4℃ 避光貯存（1）。
（2）3mol/L Tris-buffer,pH8.9： Tris base 36.6 g + 1 mol/L HCl 48 mL + ddH?O 至100 mL）
（3）0.5mol/L Tris-HCl, pH6.8 : 6.05g Tris base 溶于40mL ddH?O中，加1mol/L HCl 48mL, 加水補至100mL.
（4）5×Tris-甘氨酸電泳buffer（pH8.3):（配1L）
Tris-base 15.1g + 甘氨酸94g + 5g SDS + H2O至1L（用時稀釋5倍）。
（5）10% SDS:：稱10克SDS溶解于100mL去離子水中，貯存于室溫中。
（6）TEMED（四甲基乙二胺）：濃度10%，20 mL (全班共用)，4℃保存。
（7）10% AP（過硫酸銨）：10 mL，新鮮配制，分裝至1.5mL 離心管中，－20℃保
存待用（2）。
（8）樣品溶解液：內含1% SDS，1%巰基乙醇，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚藍，0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCL緩沖液。
* 先配制0.05 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖液：稱Tris 0.6g ，加入50 ml重蒸水，再加入約3 ml 1mol/L HCL,調pH至8.0，最后用重蒸水定容至100 ml
*如樣品為液體，則應用濃一倍的樣品溶解液，然后等體積混合。
*或配制2 X SDS樣品緩沖液：
100mmol/L Tris-HCl (pH6.8)
200mmol/L DTT
4% SDS
0.2%溴酚藍
20% 甘油
必要時加入少量（1%）巰基乙醇。
（9）考馬斯亮藍染色液(3)：0.05 g考馬斯亮藍R250溶于25 mL異丙醇里，加11 mL冰醋酸+H2O 至110 mL，用濾紙過濾除去不溶物。
（10）0.1%溴酚藍指示劑（全班共用）
（11）脫色液：75 mL冰乙酸 + 50 mL甲醇 + 875 mL H2O（若只配500 mL，各物質減半）
（二）器材
① 電泳儀
② 垂直板電泳槽，電泳板
③微量進樣器（50μL）
④染色/脫色搖床。
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