細胞早期凋亡檢測方法Annexin V

General Annexin V Staining Procedure

備用試劑
1. 結合緩沖液 (10X ): 0.1 M HEPES, pH 7.4; 1.4 M NaCl; 25 mM CaCl2 . 稀釋到1X 工作液備用;
2. 碘化丙碇Propidium Iodide (PI). 用PBS稀釋到 50 μg/ml備用,建議與Annexin V-FITC聯合使用;
3. 7-AAD. 推薦與Annexin V-PE或者Annexin V-Biotin 聯合使用;
4. 1X PBS 室溫儲存備用;

染色步驟
1、用預冷的PBS洗滌細胞兩次,之后用1X的結合緩沖液重懸細胞, 調節細胞濃度到1X106Cells/ml;
2、取100μl調節好濃度的細胞懸液到5ml流式管底部;
3、加入Annexin V標記蛋白和相應的核酸染料(標記的Annexin V與核酸染料均需要摸索到合適的使用濃度,商品化試劑盒按照說明書操作);
4、均勻混合,室溫避光反應15分鐘;(若是用Annexin V-Biotin標記蛋白染色,反應后用1X的結合緩沖液洗滌細胞一次,再加入合適濃度的標記鏈霉親和素Streptavidin,再加入合適的核酸染料,室溫避光反應15分鐘)
5、向流式管中加入400μl 1X的結合緩沖液,重懸后及時上流式細胞儀進行分析.

建議設置對照管
實驗中需要設置空白對照管(只加細胞) 和單染調節補償管(分別用標記的Annexin V和核酸染料做單染管),這些對照管在實驗中用來調節儀器補償和劃定Quadrants.
實驗中還需要設置同時培養的沒有做藥物誘導凋亡的對照組管, 還可以加上一組很容易誘導凋亡的細胞對照組, 以證明染色體系沒有錯誤。

操作注意事項(個人經驗)
1、補償對照管很重要;
2、細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞;
3、細胞濃度與染色用的蛋白量要合適;
4、對不同藥物濃度和藥物作用時間要進行摸索;

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