動(dòng)物血中超氧化物歧化酶的提取和活性測(cè)定
[原理]
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，簡(jiǎn)稱 SOD)廣泛存在于生物體內(nèi)的含Cu、Zn、Mn、Fe的金屬類酶。它作為生物體內(nèi)重要的自由基清除劑，可以清除體內(nèi)多余的超氧陰離子，在防御生物體氧化損傷方面起著重要作用。離子(0 2 - )是人體氧代謝產(chǎn)物，它在體內(nèi)過量積累會(huì)引起炎癥、腫瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧陰離子與生物體內(nèi)許多疾病的發(fā)生和形成有關(guān)。由于SOD能專一消除超氧陰離子(O 2 - )而起到保護(hù)細(xì)胞的作用，SOD作為一種藥用酶，具有廣闊的應(yīng)用前景，并引起了國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界、生物界和食品界的極大關(guān)注。
按金屬輔基成分的不同可分成3種類型。最常見的一種含有銅鋅金屬輔基(CuZn-SOD)，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙也有存在，CuZn-S0D酶蛋白的分子量約為3.2×10 4 ，純品呈藍(lán)綠色，每個(gè)酶分子由2個(gè)亞基通過非共價(jià)鍵的疏水基相互作用締合成二聚體。每個(gè)亞基(肽鏈)含有銅、鋅原子各一個(gè)，活性中心的核心是銅。第二種含有錳離子(Mn-SOD)，主要存在于真核細(xì)胞的線粒體和原核細(xì)胞中，在植物的葉綠體基質(zhì)和類囊體膜上也有存在，純品呈粉紅色，由4條或2條肽鏈組成。第三種是Fe-S0D，過去一直認(rèn)為只存在于原核細(xì)胞中，近來發(fā)現(xiàn)有一些真核藻類甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD純品呈黃色或黃褐色，由2條肽鏈組成，多數(shù)情況下每一個(gè)二聚體中含有一個(gè)Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次從牛血中提純到超氧化物岐化酶。 自然界中SOD分布極廣，其含量隨生物體的不同而不同，即使同一種生物的不同組織或同一組織的不同部位，其SOD的種類和含量也有很大差別。迄今為止人們已從細(xì)菌，真菌、原生動(dòng)物。藻類、昆蟲、魚類、植物和動(dòng)物等各種生物體內(nèi)分離得到SOD。為拓寬提取SOD的原料，篩選或基因過程開發(fā)產(chǎn)SOD量較高的菌株。目前，研究開發(fā)最多的資源還是從動(dòng)物血液、動(dòng)物組織中制備提純SOD。
SOD的活力測(cè)定方法很多，常見的有化學(xué)法、免疫法和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會(huì)產(chǎn)生有色中間物和O 2 - ，利用SOD分解而間接推算酶活力。在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，NBT-還原法，光化學(xué)擴(kuò)增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用。化學(xué)發(fā)光法和光化學(xué)擴(kuò)增法不適用于測(cè)定Mn-SOD，但對(duì)于Cu/Zn-SOD反應(yīng)極靈敏。Cyte還原法用于Mn-SOD活力測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。但專一性和靈敏度不夠理想，而且需要特殊 儀器 ，實(shí)際應(yīng)用受到限制。亞硝酸鹽形成法與CN—抑制劑或SDS處理相結(jié)合，應(yīng)用于Mn-SOD測(cè)定，靈敏度比Cyte還原法提高數(shù)倍，而且專一性強(qiáng)，重復(fù)性好，操作方便，不需要特殊 儀器 和設(shè)備，易于實(shí)際應(yīng)用和推廣，是目前較好的測(cè)定方法之一。
在一般情況下，SOD酶活性測(cè)定只能應(yīng)用間接活性測(cè)定法。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化方法。
鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O 2 - ，生成帶色的中間產(chǎn)物，反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。這里測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段，中間物的積累在滯留30～45s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在420nm波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化O 2 - 與H + 結(jié)合生成O 2 和H 2 O 2 ，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，因此，通過計(jì)算即可求出SOD的酶活性。
酶活力單位定義：在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。
[方法和步驟]
1、從豬血中提取SOD
（1） 分離血球
取新鮮豬血，加入到3.8%檸檬酸三鈉抗凝液中，新鮮豬血與抗凝液的比例為3：1，輕輕攪拌均勻，4 000r/min離心20min，收集紅血球。
（2）除血紅蛋白
紅血球用3倍體積生理鹽水洗滌，4 000r/min離心20min，重復(fù)三次，然后向洗凈的紅血球加入1～1.1倍體積去離子水，攪拌溶血30min，再向溶血液中分別緩慢加入0.25倍體積的預(yù)冷95%乙醇和0.15倍體積的預(yù)冷氯仿，劇烈攪拌15min左右，靜置1h，然后4 000r/min離心20min除去變性血紅蛋白沉淀，取清液，過濾，收集濾液（記錄體積，測(cè)酶活性和蛋白濃度）。
（3）熱變性
上清液加熱到65℃，保溫10min，然后迅速冷卻到室溫，3 000r/min離心20min，棄去沉淀物，收集上清液（記錄體積，測(cè)酶活性和蛋白濃度）。
（4）沉淀
清液在鹽冰浴中冷卻，然后在-5℃以下的操作溫度下，加入1.5倍量預(yù)冷丙酮，邊加邊攪拌均勻，即有白色沉淀產(chǎn)生，靜置2～3min，迅速抽濾，棄去濾液得肉色沉淀。沉淀物用少量蒸餾水溶解，4 000r/min離心20min，除去不溶物，用pH7.6的2.5mmol/L K 2 HPO 4 -KH 2 PO 4 緩沖液透析，即得粗SOD溶液（記錄體積，測(cè)酶活性和蛋白濃度）。
2、SOD酶活性測(cè)定
（1）鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定
取兩支試管按下表加入25℃預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。
試劑 | 空白管（mL） | 自氧化管（mL） |
pH8.2、50mmol/L Tris-HCl | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
（2）、SOD樣液的活性測(cè)定
樣品管取代自氧化管。樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)熱的待測(cè)酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定。
試劑 | 空白管（mL） | 樣品管（mL） |
pH8.2、50mmol/L Tris -HCl | 2.98 | 2.98 |
10mmol/L HCl | 0.02 | - |
SOD樣液 | - | 0.01 |
50 mmol/L鄰苯三酚 | - | 0.01 |
（3）計(jì)算
3、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
[結(jié)果與計(jì)算]
1、 計(jì)算每步操作所得酶液的酶活性、蛋白濃度和比活力。
2、計(jì)算每步操作的酶活性回收率、蛋白回收率和純化倍數(shù)。
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