基因轉(zhuǎn)染技術(shù)
常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將外源基因?qū)氚屑?xì)胞需要一定的載體和導(dǎo)入方法，基因轉(zhuǎn)技術(shù)則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染方法有多種，根據(jù)不同的細(xì)胞，貼壁或懸浮細(xì)所可選用不同的方法，其目的是要達(dá)到設(shè)置轉(zhuǎn)染效率，影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種，包括轉(zhuǎn)染方法、操作技術(shù)、質(zhì)粒DNA的純度、靶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)等，下面重點(diǎn)介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)：
被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長(zhǎng)狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一將近新鮮培養(yǎng)液。對(duì)于懸浮細(xì)胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。
用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RNA和其了化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。應(yīng)用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，目前大多采用進(jìn)口的術(shù)提取純化試劑盒。
具體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有鱗酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)塵等。靶基因被導(dǎo)入細(xì)胞后，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，最常用的直核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
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