種子蛋白質(zhì)系統(tǒng)分析：種子蛋白質(zhì)亞基分析（SDS

一、目的
蛋白質(zhì)分子有單鏈、雙鏈和寡聚蛋白等組成形式，組成蛋白質(zhì)分子的單條肽鏈又稱亞基。通過對(duì)天然蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳和變性蛋白的SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜 的比較，可以研究種子蛋白質(zhì)分子組成和結(jié)構(gòu)。另外，SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳是測(cè)定亞基分子質(zhì)量的好方法。通過本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)SDS 一聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理、技術(shù)和實(shí)際應(yīng)用。
二、原理
用十二烷基硫酸鈉（SDS）和還原劑（琉基乙醇或二硫蘇糖醇）熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵被還原，解離的亞基與SDS 發(fā)生1 : 1.4 的定量結(jié)合。SDS 使蛋白質(zhì)亞基帶上大量負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)各種亞基間原有的電荷差異。亞基的構(gòu)象均呈長(zhǎng)橢圓棒狀，各種蛋白質(zhì)亞基-SDS 復(fù)合物表現(xiàn)出相等的電荷密度。在電場(chǎng)中其遷移速率僅與亞基分子質(zhì)量有關(guān)，因此，SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳 可以進(jìn)行蛋白質(zhì)亞基分離，并用來測(cè)量蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量。
三、儀器、試劑和材料
1．儀器
( 1）穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀
( 2）垂直板電泳槽
( 3）微量注射器
( 4）燒杯50ml X2
( 5）白瓷盤
( 6）脫色搖床
( 7）吸管0.5ml X 2 , 5mlx2 , 10mlx3
( 8）真空泵
( 9）臺(tái)式高速離心機(jī)
2．試劑
( 1 ) 2％瓊脂2g 瓊脂加電極緩沖液100 ml，水浴中溶化。
( 2）電極緩沖液Tris 6g , Gly28.8g , SDS 2g ，去離子水溶解后，用Hcl 調(diào)pH 值至8.3，水定容至2000ml 。
( 3 ) 30 % Aer Acr 30g，水溶后定容至100ml，過濾，冰箱中貯存?zhèn)溆谩?br style="box-sizing: border-box;"/>( 4 ) 1 % Bis Bis 1g ，水溶后定容至100ml，過濾，冰箱中貯存。
( 5）分離膠緩沖液（1.5mol / L Tris , pH8.7 ) Ths 15.17g，適量水溶解，然后用lmol
/ L HCI 調(diào)pH 值至8.7，定容至100ml 。
( 6）濃縮膠緩沖液（0.5mol / L Tris-Hcl , pH6.8 ) Tris 6.06g ，適量水溶解，然后用 lmol / L HCI 調(diào)pH 值至6.8，定容至l00ml。
( 7 ) 10 % SDS SDS 1g，加水10ml 溶解。
( 8 ) 10％過硫酸銨1g 過硫酸銨，加水10ml 溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，冰箱中最多可貯存一周。
( 9 ) TEMED（四甲基乙二胺）4℃，棕色瓶中貯存。
( 10）樣品緩沖液（pH8.0 ) Tris 6.05g，甘油50ml，巰基乙醇25ml，溴酚藍(lán)0.5g ,SDS l0g，溶于水，用HCI 調(diào)PH 至8.0，定容至500ml。
( 11）脫色液 甲醇：乙酸：水＝5 : 1 : 5（體積比）
( 12）染色液（0.25％考馬斯亮藍(lán)R250）1.00g 考馬斯亮藍(lán)R250，用脫色液400ml溶解，過濾備用。
( 13）低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，包括溶菌酶（MW = 14 400Da）大豆胰蛋白酶抑制劑（21 5000）、碳酸酐酶（310000）、卵白蛋白（450000）、牛血清白蛋白 (66 2000）、磷酸化酶B (92 5000）。用樣品緩沖液配成2mg / ml 溶液，在沸水浴中加熱3-4min，冷卻后使用。

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