高效液相色譜法測定脂溶性維生素
一、實驗目的
1.熟悉高效液相色譜的原理及分析方法。
2.掌握高效液相測定脂溶性維生素的方法。
二、實驗原埋
樣品中的維生素A 及維生素E 經皂化處理后，將其不可皂化部分提取至有機溶劑中。用高效液相色譜法C18反相柱將維生素A 和維生素E 分離，經紫外檢測器檢測，并用內標法定量測定。該法最小檢出量分別為：VA：0.8ng ；α-E：9l.8ng ；γ-E：36.6ng ；δ-E：20.6ng.
三、儀器和試劑
儀器
高壓液相色譜儀 帶紫外分光檢測器、旋轉蒸發器、高速離心機；小離心管：具塑料蓋1.5~3.0mL塑料離心管(與高速離心機配套)、高純氮氣、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計。
2.試劑
實驗用水為蒸餾水。試劑不加說明為分析純。
1.無水乙醚：重蒸，不含有過氧化物。
過氧化物檢查方法：用5mL 乙醚加1mL 10%碘化鉀溶液，振搖1min。如有過氧化物則放出游離碘，水層呈黃色或加4滴0.5%淀粉液，水層呈藍色。
去除過氧化物的方法：瓶中放人純鐵絲或鐵沫少許，重蒸乙醚。棄去10%初餾液和10%殘餾液。
2.無水乙醇：重蒸，不含有醛類物質。
檢查方法：取2mL 銀氨溶液于試管中，加入少量乙醇，搖勻，再加入10%氫氧化鈉溶液，加熱，放置冷卻后，若有銀鏡反應則表示乙醇中有醛。
銀氨溶液：加氨水至5%硝酸銀溶液中，直至生成的沉淀重新溶解為止，再加10%氫氧化鈉溶液數
滴，如發生沉淀，再加氨水直至溶解。
脫醛方法：將2g 硝酸銀溶于少量水中，4g 氫氧化鈉溶于溫乙醇中，然后將兩者傾入1L 乙醇中，振搖后，放置暗處兩天(不時搖動，促進反應)，過濾，置蒸餾瓶中蒸餾，棄去初蒸出的50mL。當乙醇中含醛較多時．硝酸銀用量適當增加。
3.無水硫酸鈉。
4.甲醇：色譜純或分析純重蒸后使用。
5.重蒸水：蒸餾水中加少量高錳酸鉀，臨用前重蒸。
6.10%抗壞血酸溶液(W/V)：臨用前配制。
7.50%氫氧化鉀溶液(W/V)
8.維生素A 標準液：視黃醇(純度85%)或視黃醇乙酸酯(純度90%)經皂化處理后使用。用脫醛乙醇溶解維生素A 標準品，使其濃度大約為1mL 相當于1mg 視黃醇。臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度.
9.維生素E 標準液: α-生育酚(純度95%)，γ-生育酚(95%)，δ-生育酚(純度95%)。用脫醛乙醇分別溶解以上三種維生素E 標準品，使其濃度大約為1mg/mL。臨用前用紫外分光光度分別標定此三種維生素E 的準確濃度。
10.內標溶液：稱取苯并
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