重組質(zhì)粒中目的基因的分離與純化
先取少量純化的重組質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶切出目的基因，經(jīng)電泳分離，確認(rèn)。以200μl含2mg DNA（重組質(zhì)粒）為例：取10μl含100μg DNA，加90μl TE。按1μg DNA加2-5U限制性內(nèi)切酶，1/10體積緩沖液，1-2小時(shí)保溫。緩沖液種類和酶反應(yīng)溫度因內(nèi)切酶種類而異。1/10體積3mol/l NaAc，2倍無水乙醇，－70℃，2小時(shí)（－20℃過夜），10000rpm，10分鐘離心，棄上清液（乙醇沉淀）。適量TE溶解沉淀（切斷的DNA質(zhì)粒與目的基因混合物），電泳分離（用相應(yīng)分子量DNA標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)電泳），在紫外光下觀察結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，確認(rèn)目的基因和內(nèi)切酶的切割效果。
經(jīng)電泳確認(rèn)后，取適量DNA（重組質(zhì)粒）同上條件切開，用1.5％低熔點(diǎn)（＜65℃熔解）瓊脂糖凝膠，電泳分離。在紫外光下，切出含目的基因區(qū)帶（凝膠），放入離心管中，提取純化。
從低熔點(diǎn)凝膠提取，純化DNA片段。加與凝膠體積相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分鐘保溫，使凝膠完全溶解。待放至室溫，加等量酚（TE飽和，TE封在上層，取下層酚），輕輕混勻（不用混勻），12000rpm，3分鐘離心。反復(fù)1-2次。取上層液，加0.1體積3mol/L醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積無水乙醇，進(jìn)行乙醇沉淀。將純化的DNA加適量TE溶解，測定含量，備用（可用于目的基因結(jié)構(gòu)分析，探針制備等）。除低熔點(diǎn)凝膠回收法外，如用一般凝膠可用透析帶短暫電泳，離心管低部加玻璃棉，高速離心等方法回收DNA片段。
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