脲酶的動力學(xué)研究
一、實驗?zāi)康?br style="box-sizing: border-box;"/>1.了解酶動力學(xué)的研究的一般內(nèi)容及方法。
2.掌握脲酶的動力學(xué)研究的操作步驟。
二、實驗原理
本實驗以脲酶(Mrease)為例研究底物濃度、pH、抑制劑(磷酸根離子)濃度對反應(yīng)速度的影響，并學(xué)會計算Km、V 等常數(shù)。
脲酶廣泛分布于植物界的種子中，某些微生物中也有，但在刀豆和大豆中含量較豐富。脲酶特異性地促使脲水解釋放出氨和二氧化碳，其反應(yīng)如下：
脲酶屬于一種寡聚酶44，分子量約為483000，等電點為4.8，最適pH 7.0。脲酶的Km 值因其來源不同和測定條件不同而異，例如刀豆脲酶，用pH7.0Tris-硫酸緩沖蔽，Km 為5.1×10 -3 MoL／L；本實驗是用大豆脲酶粗制品，pH7.0 Tris-硫酸緩沖液，25℃保溫，所測Km 值約為3.0×10 -3 mol/L 左右。
通過測定氨的釋放速度，就可得知水解速度。文獻(xiàn)中多采用奈氏(Nessler)試劑顯色法測定所釋放的氨量。其反應(yīng)如下：
由于該方法手續(xù)較繁，試劑也較貴，我們只用奈氏試劑作酶活力初步鑒定，而以康維(Conway)
微量等溫蒸餾定氨法測定氨量。
三、 儀器 和試劑
儀器
秒表、康維皿、細(xì)玻棒、恒溫水浴、恒溫箱、微量水平滴定管、吸量管。
實驗原料：新鮮大豆粉
試劑
1. 30％乙醇(V／V)
2. 人造浮石：Permutite 顆粒狀人造浮石。
3. 2％乙酸
4. 0.1mol/LpH7.0 Tris-硫酸緩沖液：取25mL2mol/LTris 溶液，加21mL0.1mol/L 硫酸，用水定容到50mL，檢查pH。
5. 3％脲－5.4％磷酸氫二納—4.25％磷酸二氫鉀溶液
6. 奈氏(Nessler) 試劑 :稱取5g 碘化鉀，溶于5mL 蒸餾水中，加入飽和氯化汞溶液(100mL 水約溶解
5．7g 氯化汞)，并不斷攪拌，直至產(chǎn)生紅色沉淀不再溶解時．再加40mL50％氫氧化鈉溶液，稀釋至100mL，混勻，靜置過夜，傾出清液貯存于棕色瓶中。
7. 0.020mol/L、0.040 mol/L、0.060mol/L、0.080 mol/L、0.10 mol/L、0.16 mol/L 脲溶液。
8. 0.1mol/L、0.4mol/L、0.8mol/LPH7.0磷酸鹽緩沖液。
9. 0.1mol/L，pH5.0、pH6.0、pH7.0、PH8.0、PH9.0Tris—硫酸緩沖液。
10. 0.02 mol/L 準(zhǔn)硫酸銨溶液
11. 微量等溫蒸餾定氨所用試劑
12. 1mol/L 鹽酸
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