親和層析制備胰蛋白酶抑制劑
[原理]
雞卵類粘蛋白是一種專一性很強(qiáng)的胰蛋白酶的抑制劑，對(duì)豬和牛的胰蛋白酶有很強(qiáng)的抑制作用（而對(duì)胰凝乳蛋白酶無(wú)抑制作用）。
雙功能 試劑 β-硫酸脂乙砜基苯胺（SESA）活化珠狀交聯(lián)瓊脂糖，重氮化后與胰蛋白酶偶聯(lián)形成親和吸附劑，來(lái)制備卵粘蛋白。
[方法和步驟]
1、親和吸附劑——固定化胰蛋白酶的制備
（1）對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSE）-瓊脂糖制備
①濾干的瓊脂糖凝膠12g加入10 mL蒸餾水以1mol/L NaOH溶液調(diào)pH至13。
②SESA 0.8g懸于5mL蒸餾水中，攪拌下緩慢用1.5mol/L Na 2 CO 3 溶液調(diào)pH至6.0，待溶解后離心。
③把上述二者混合放入沸水浴中，待溫度達(dá)到60℃時(shí)，立即加入Na 2 CO 3 0.25g，繼續(xù)在沸水浴中維持45min。
④抽濾后用0.5mol/L NaOH溶液洗三次，再用蒸餾水洗三次抽干，即得ABSE-瓊脂糖。
（2）ABSE-瓊脂糖重氮化
①ABSE-瓊脂糖凝膠懸于10mL蒸餾水中，放入冰浴中，攪拌下依次加入預(yù)冷的1mol/L HCl 10 mL和5% NaNO 2 溶液10 mL，冰浴中間歇攪拌20min。
②過(guò)濾并用預(yù)冷的0.05 mol/L HCl洗三次，冷蒸餾水洗三次抽干即為重氮鹽衍 生物 。（3）胰蛋白酶的偶聯(lián)
將ABSE-瓊脂糖重氮衍 生物 立即投入10ml/mL胰蛋白酶溶液，立即用1.5mol/L Na 2 CO 3 維持PH8.0，冰浴中間歇攪拌1.5h，再以少量1mol/L NaCl溶液洗二次，蒸餾水洗三次即可得固定化胰蛋白酶。
2、親和層析純化卵粘蛋白
（1）裝柱
將制得的固定化胰蛋白酶懸浮于約一倍體積的0.1mol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.5）中，按常規(guī)裝柱。
（2）平衡
用約50mL的0.1mol/L Tris-HCl，pH7.5緩沖液過(guò)柱平衡，流速2mL/min，直至流出液pH與緩沖液一致。
（3）親和吸附：
取2 mL充分打勻的新鮮雞蛋清，加入10 mL稀釋，用電磁 攪拌器 打勻，過(guò)濾后上柱吸附，流速小于3滴/min。
（4）洗滌
用0.1mol/L Tris -HCl，pH7.5 緩沖液 洗柱，流速小于2mL/min，直至流出液A 280 處讀數(shù)不大于0.05。
再用0.01mol/L pH4.8乙酸 緩沖液 洗滌，流速1mL/min，直至流出液在A 280 的讀數(shù)小于0.05。
（5）洗脫
用0.05mol/L PH2.5甘氨酸緩沖液進(jìn)行洗脫，流速小于5滴/min，每管3mL收集，依次測(cè)定各管A 280 。將峰值管收集液合并，得純化的卵粘蛋白。
[結(jié)果和計(jì)算]
1、以A 280 為縱坐標(biāo)，洗脫管號(hào)或洗脫收集液體積為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線圖。
1、 計(jì)算上柱前和洗脫收集所得卵粘蛋白的蛋白質(zhì)總量，求出蛋白回收率。
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