蛋白質分子量的測定——葡聚糖凝膠過濾法
實驗原理
葡聚糖凝膠（Sephadex）過濾法測定蛋白質分子量的原理，主要是依據這種凝膠具有分子篩作用，一定型號的凝膠具有大體上一定大小的孔徑。在一定的凝膠柱內，凝膠孔隙所占的體積稱為內水容積Vi，凝膠顆粒間的自由空間所占的體積稱為外水容積V0。當樣品流經凝膠柱時，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內部，只需V0體積的洗脫液便可將其由一端洗脫到另一端；相反，如果樣品體積小于孔隙，則需要V0＋Vi體積的洗脫液，才能將它們由一端洗脫到另一端。中等分子（分子大小在上述兩種極限之間）所需洗脫液體積介于兩者之間，Ve＝V0＋KdVi（0<Kd<1），如圖4.1所示。
Kd為分配系數(shù)，它表示一種物質在孔隙內的滲透程度，相當于這種物質在孔隙內所占體積和孔隙總體積的比值。
如果假定蛋白質分子近于球形，同時沒有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質，進入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小。當?shù)鞍踪|分子量在10000～15000時，蛋白質在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對數(shù)呈直線關系。若用已知分子量的標準蛋白質在一定型號葡聚糖凝膠柱上層析，精確測其洗脫體積，并以洗脫體積Ve對分子量的對數(shù)logMW作圖，可獲得一條標準曲線（見圖4.2）。未知分子量的蛋白質在相同條件下層析，根據其洗脫體積即可在標準曲線上求得分子量。
圖 4.2三個不同大小分子組份上柱洗脫曲線示意圖
本方法測分子量設備簡單，結果處理方便，因此應用較廣泛。但本方法僅適用于軸比相近似為球狀蛋白，對軸比大的纖維蛋白不適用；對含量大于5%的糖蛋白因有較大水合作用，測得分子量偏高；對含鐵蛋白測定數(shù)據偏低。
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