原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（in situ PCR）和原位反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（in situ RT-PCR）操作規(guī)程

（一）、儀器設(shè)備
英國(guó) Thermo Hybaid 原位 PCR 儀。
（二）、操作流程
1 、原位 PCR 步驟
1 ）預(yù)處理：
（ 1 ）切片常規(guī)脫蠟；
（ 2 ） 0.2mol/L HCl 處理 10min ；
（ 3 ） 5 μ g/ml 蛋白酶 K 消化組織 37 ℃ 10min ；
（ 4 ） Nase 消化組織 37 ℃ 30min ；
（ 5 ）梯度酒精脫水，室溫干燥。
2 ）原位擴(kuò)增：
（ 1 ）切片滴加特異性序列引物 30 μ LPCR 擴(kuò)增反應(yīng)液，覆蓋硅化蓋玻片，石蠟油封邊；
（ 2 ） PCR 熱循環(huán)： 94 ℃， 1min ； 55 ℃， 1min ； 72 ℃， 1.5min ，共 25 ～ 30 個(gè)循環(huán)， 72 ℃延伸 10min ；
（ 3 ）氯仿洗去蓋玻片， 4 ％多聚甲醛后固定 10min ，梯度酒精脫水，干燥。
3) 原位雜交：
（ 1 ）加地高辛標(biāo)記探針的雜交液， 98 ℃變性 10min ， -20 ℃退火 5min ， 42 ℃雜交過(guò)夜。
（ 2 ）雜交后用 2×SSC 洗滌 10min ， 3 次， 1×SSC 洗滌 10min ， 3 次；
（ 3 ）緩沖液洗滌 10min ， 3 次；
（ 4 ）加堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗地高辛抗體復(fù)合物， 37 ℃， 2h ；
（ 5 ）緩沖液洗滌 5min ， 3 次；
（ 6 ） NBT 、 BCIP 暗處顯色，鏡下控制，終止顯色。
（ 7 ）常規(guī)脫水：透明、封固。
2 、原位 RT-PCR 步驟
1 ）預(yù)處理：
（ 1 ）蛋白酶 K(0.3mg/mL) 54 ℃消化 20min ，蒸餾水洗；
（ 2 ） 95 ℃加熱 3min ，滅活殘存的蛋白酶。
2 ）原位擴(kuò)增：
（ 1 ）在有 RNA 酶抑制劑存在的條件下，用隨機(jī)六聚物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；
（ 2 ）用熱啟動(dòng)法進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。標(biāo)本加熱至 75 ℃時(shí)加上反應(yīng)液，覆以蓋玻片，四周用指甲油密封。然后將溫度升至 95 ℃， 2min 。再將熱循環(huán)儀設(shè)定為 95 ℃， 45s ， 55 ℃， 1min 和 75 ℃， 45s ，共 26 次循環(huán)；
（ 3 ）擴(kuò)增結(jié)束后，在 80 ℃烤 15min ～ 30min 。
3 ）原位雜交：
（ 1 ）雜交前標(biāo)本 95 ℃加熱 3min ；
（ 2 ）加上雜交液，濕盒內(nèi) 50 ℃過(guò)夜； 雜交液組成： 25 ％硫酸葡聚糖， 2×SSC ， 50 ％甲酰胺， 0.33mg/ml 變性的鮭魚(yú)精子 DNA ， 每 0 ． 5mL 雜交液內(nèi)含生物素標(biāo)記探針 1ng 。
（ 3 ）擴(kuò)增的β - 肌動(dòng)蛋白和 IL-6 用 DAKO 檢測(cè)試劑盒 K600( 鏈霉卵白素，生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶和硝基四氮唑藍(lán) ) 檢測(cè)。陽(yáng)性反應(yīng)呈紫色。

北京天優(yōu)福康生物科技有限公司

官網(wǎng)：http://m.jyzjsd.com/

服務(wù)熱線：400-860-6160 

聯(lián)系電話/微信：13718308763  

QQ:2136615612      3317607072

E-mail：Tianyoubzwz@163.com