原位雜交實驗步驟
一質粒制備
1質粒的轉化和擴增
1.1制備XL1-Blue感受態細菌
1．取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mlLB培養基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重懸細菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌，分裝(200μ／tube)，-80℃保存。
2．轉化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態菌中。
3．輕輕搖勻，冰浴30min。
4．42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5．加入LB培養液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37℃，100轉／min水浴孵育60min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨芐青霉素50mg／ml,1μl／ml培養基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養12-16h。
1.2鑒定和挑選含重組質粒的菌落
1．用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養液的離心管中，于37℃，200轉／分培養2h，取1ml之一Eppendorf離心管，加50μl10mmol／LEDTA(pH8.0)。
2．加入50μl新配置的0.2mol／LNaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩30秒。
3．在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。
4．加1.5μ14mol／LKCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4℃離以3min，以除去細菌碎片。
6．制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V，進行電泳。
7．當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2／3-3／4時，停止電泳，在紫外燈下檢查質粒DNA分于量的大小是否與轉入質粒相符。
1.3質粒的擴增和純化
1．用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg／ml)培養液的聚丙烯管中，于37℃，200轉／分培養3h。
2．將菌液轉入含70mlLB-氨芐青霉素培養液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉／分培養過夜(12-16h)，細菌渾濁。
3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170μ／ml)。37℃，200轉／分培養12-16h。
4.將培養的細菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細菌。
5.棄凈上清夜，用2ml預冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數次后，于室溫靜置10min。
7.加入預冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現白色絮狀沉淀。
8．6000rpm，4℃離心15min，保留上清。
9．將上清(若帶細菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10min。(或-20℃4h，或4℃過夜，可便核酸沉淀)
10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
12．用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉移至1.5mlEppendorf管中。
13．加入用冰預冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發殆盡。
17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉移到另－1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。
18．加入400μl13％(v／v)的PEG8000-NaCl(1.6mol／L)，混勻，4℃12000rpm離心5min以回收質粒DNA，棄去上清。
19．加入400μlTE緩沖液(pH8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．將水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積(大約1ml)的無水乙醇，充分混勻后于4℃放置30min。
21．于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發殆盡。
22．加入400μl處于4℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。
23．吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇完全揮發。
24．用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質粒DNA的純度和濃度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對DNA而言其值大約為
1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質污染。；DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數(μg／μl)。
26．質粒DNA溶液于-20℃保存待用。
二、cRNA探針的標記
1．將質粒DNA，用相應的限制性內切酶線性化，通過瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。
2．線性化后的DNA按“質粒的純化”步驟19-24進行純化，作為cRNA探針標記的模板，用相應的RNA聚合酶合成地高辛標記的反義和正義RNA探針。
3．進行體外轉錄，步驟如下：
4．在冰上將各 試劑 加入一1.5ml無RNA酶的Eppendorf管中。
北京天優福康生物科技有限公司
官網：http://m.jyzjsd.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
