丙型肝炎病毒準(zhǔn)種特性的研究進(jìn)展

關(guān)鍵詞： 丙型肝炎病毒 準(zhǔn)種特性 研究進(jìn)展

　　丙型病毒性肝炎(丙肝)是一種廣泛傳播的疾病，是導(dǎo)致慢性病毒性肝炎、肝炎肝硬變、肝細(xì)胞癌(HCC)的主要病因之一，而這些病變形成與其病原丙型肝炎病毒（HCV)某些重要的生物學(xué)特性有關(guān)〔1〕。與其他RNA病毒類似，HCV基因組的易變異性可產(chǎn)生不同的型或亞型，而且在HCV感染者體內(nèi)可同時(shí)存在具有多種序列組成不同但卻有很高同源性(同源性≥95%)的HCV變異株病毒群體，即稱為HCV準(zhǔn)種(Quasispecies)，亦有相似株和類似株之稱〔2,3〕。近年來研究表明，HCV準(zhǔn)種株決定其某些重要的生物學(xué)特性，而且大部分學(xué)者己慣用“準(zhǔn)種”來監(jiān)測(cè)和量化HCV在患者體內(nèi)的復(fù)制及變異。現(xiàn)就有關(guān)研究作一概述。

　　1　HCV準(zhǔn)種株特性

　　1971年Eigen等〔4〕在描述地球早期生命演化時(shí)，啟用了“準(zhǔn)種株”這一概念。以后人們?cè)诜治鍪删wQβ群中單個(gè)病毒克隆的RNA時(shí)發(fā)現(xiàn)“準(zhǔn)種株”的確存在，并將其引入了病毒的研究，以求循一個(gè)新途徑來解釋和說明病毒的高度變異性問題〔5〕。HCV屬于單股正連RNA病毒，其基因組包膜糖蛋白區(qū)E2/NS1基因組C端相對(duì)保守，N端含有兩個(gè)高變區(qū)域(Hypervariable region，HVR)即HVR1(384～410/413 aa)和HVR2(474～480 aa)。研究發(fā)現(xiàn)HVR1含有病毒株特異的中和性抗原表位，它的變異與丙肝慢性化及防治失敗密切相關(guān)〔6〕。HCV感染者體內(nèi)可同時(shí)存在大量基因序列相關(guān)的HCV準(zhǔn)種株群體，而且會(huì)隨病情和/或病程不同而發(fā)生變化〔7，8〕。這種序列異質(zhì)性變異株可發(fā)生在HCV基因組的各區(qū)段，包括5′-非編碼區(qū)(5′-UTR)、核心區(qū)(C區(qū))、包膜區(qū)（E區(qū))及非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)(NS區(qū))等均有報(bào)道〔9-11〕。最近，Gerotto等〔12〕報(bào)道了HCV-NS5A干擾素敏感決定區(qū)(IFN Sensitivity-determing region，ISDR)準(zhǔn)種特性，認(rèn)為其會(huì)影響到HCV 1b型感染者對(duì)IFN治療的應(yīng)答。但有研究證實(shí)約20%序列變異發(fā)生在E2/NS1區(qū)，HCV準(zhǔn)種株特性在HVR1表現(xiàn)較明顯而更具有代表性〔11，13，14〕。

　　2　HCV準(zhǔn)種株的量化

　　隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，目前主要以準(zhǔn)種HCV基因的復(fù)雜性(Complexity)或異質(zhì)性(Heterogeneity)程度來對(duì)其進(jìn)行量化，主要有以下幾種方法:

①直接測(cè)序法〔15〕。針對(duì)特定區(qū)段RNA序列進(jìn)行體外逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（RT-PCR)得到相應(yīng)的cDNA，然后用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序或克隆后測(cè)序，根據(jù)異質(zhì)性序列種類(diversity)來評(píng)價(jià)該區(qū)段準(zhǔn)種株多寡。

②單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(Single-strand conformation polymophism analysis,SSCP)〔l6，l7〕。此法是在完成靶DNA的PCR擴(kuò)增之后進(jìn)行單鏈DNA多態(tài)性分析的一種新方法，將單鏈擴(kuò)增DNA(引物已用同位素或熒光標(biāo)記)通過中性聚丙烯烯胺凝膠電泳(PAGE）和放射自顯影，根據(jù)其 SSCP條帶數(shù)目及位置不同則可分辨出序列單個(gè)堿基和構(gòu)型改變，由此來判斷體內(nèi)準(zhǔn)種株的復(fù)雜程度。

③異源雙鏈泳動(dòng)分析法(Heteroduplex mobility assay,HMA/heteroduplex gel shift analysis，GSA),亦稱異源雙鏈?zhǔn)聚櫃z測(cè)法（Heteroduplex tracking assay,HTA)〔10,18,19〕。此法早期主要用于艾滋病病毒異質(zhì)性研究，主要原理是基于DNA分子的變性和復(fù)性過程。在DNA經(jīng)過變性后復(fù)性時(shí)，如反應(yīng)系統(tǒng)中存在兩種或兩種以上具有一定同源性的核酸分子鏈，不同來源的兩鏈同源區(qū)可配對(duì)形成雙鏈，此即異源雙鏈;異源雙鏈內(nèi)由于存在堿基錯(cuò)配或不配區(qū)域，分子構(gòu)象發(fā)生了改變，不同于同源雙鏈，通過非變性的PAGE ，同源性越高，泳動(dòng)就越快，反之則慢。比較而言，第一種方法結(jié)果直接而可靠，但較原始且費(fèi)力費(fèi)時(shí)，直接PCR產(chǎn)品克隆和序列分析往往不能代表HCV準(zhǔn)種株的真實(shí)組成，雖容易鑒別出優(yōu)勢(shì)序列，但小的克隆很可能被忽略掉。PCR-SSCP法應(yīng)用較廣，但對(duì)低于5%的準(zhǔn)種株病毒群體亦有可能檢測(cè)不到，而且操作煩瑣〔20〕。相比之下，HMA法操作相對(duì)簡單省時(shí)，可用于基因亞型的測(cè)定。這些方法學(xué)上的差異在一定程度上可能決定了各學(xué)者在研究HCV準(zhǔn)種特性時(shí)某些結(jié)論的不一致，所以尋求一種更準(zhǔn)確、簡便而重復(fù)性較好的方法是必需的。

　　3　HCV準(zhǔn)種的優(yōu)勢(shì)株與劣勢(shì)株

　　有研究認(rèn)為〔21，22〕，對(duì) HCV準(zhǔn)種株群體變化可能有三種解釋:①HCV變異是HCV感染人體后隨時(shí)間變化而自發(fā)產(chǎn)生的;②病情嚴(yán)重時(shí)，HCV復(fù)制更加活躍，復(fù)制期間“易錯(cuò)配”(Error-prone)的RNA聚合酶導(dǎo)致了序列變異;③正性免疫選擇壓力(Positive immune selective pressure)作用所致病毒適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。因此，在大量的準(zhǔn)種株中，可能有一個(gè)或幾個(gè)主序列，主序列代表特定環(huán)境下最適應(yīng)的基因群。主序列與其他序列的關(guān)系也就構(gòu)成了復(fù)雜的“優(yōu)勢(shì)株”與“劣勢(shì)株”關(guān)系，而且很可能有序列優(yōu)勢(shì)株和功能優(yōu)勢(shì)株之別，它們與HCV感染后疾病的轉(zhuǎn)歸關(guān)系尚不清楚。Gretch等〔19〕采用HTA方法觀察了5例HCV-1型感染患者肝移植前后血清中HCV HVR1準(zhǔn)種及優(yōu)勢(shì)株(Major varants)的變化。發(fā)現(xiàn)3例移植后再發(fā)嚴(yán)重肝病的患者，其移植前存在的優(yōu)勢(shì)株在移植后即出現(xiàn)了明顯的復(fù)制增殖并伴隨病情從急性發(fā)展為慢性;相反，在2例移植后發(fā)展為無癥狀的感染者體內(nèi)，雖然病毒滴度仍高，但移植正常肝后原來的優(yōu)勢(shì)序列很快消失，而在 30 d左右即出現(xiàn)了新的HVR1準(zhǔn)種株，序列分析發(fā)現(xiàn)，新的病毒準(zhǔn)種株實(shí)際上來源于移植前就存在的次要變異株（＜5%HVR克隆)。作者認(rèn)為HCV感染患者血清中有一種或多種優(yōu)勢(shì)變異株存在，與同時(shí)存在的其它次要株之間關(guān)系復(fù)雜，它們?cè)诟谓M織嗜性、致病能力、肝外復(fù)制及免疫壓力選擇作用方面可能均不一致，從而聯(lián)系到不同的疾病過程。國內(nèi)潘文勝等〔23〕對(duì)兩例HCV持續(xù)感染患者5年的HVR基因變異研究發(fā)現(xiàn):①HVR的變異具有高度復(fù)雜性，但不是雜亂無章，而是有規(guī)律地朝著一個(gè)方向發(fā)展，不管是感染早期的優(yōu)勢(shì)克隆或劣勢(shì)克隆，隨著病程發(fā)展，絕大多數(shù)均會(huì)消失，取而代之的是新的優(yōu)勢(shì)克隆;②HVR變異存在優(yōu)勢(shì)克隆劣轉(zhuǎn)的現(xiàn)象，可能由于免疫系統(tǒng)首先攻擊的主要對(duì)象是優(yōu)勢(shì)克隆，逃避免疫清除的劣勢(shì)克隆可優(yōu)勢(shì)化，這也解釋了按優(yōu)勢(shì)克隆合成的多肽沒有完全保護(hù)性的現(xiàn)象。

　　4　HCV準(zhǔn)種株的分布

　　有研究表明，HCV可在肝外組織復(fù)制，Sakamoto等〔24〕研究曾發(fā)現(xiàn)不同丙肝的臨床病程中，患者肝組織及血漿中的HCV準(zhǔn)種株并無明顯差異。但目前大部分學(xué)者認(rèn)為其分布是不一致的，這種分布差異性具體機(jī)理尚不清楚;不過，肝外組織或細(xì)胞檢出HCV準(zhǔn)種株均提示HCV感染，而不是簡單的病毒吸附作用〔15，22〕。這種異質(zhì)性序列分布差異在用HCV感染黑猩猩時(shí)亦有報(bào)道，且某些有特別優(yōu)勢(shì)包括能逃避宿主免疫和在某些組織內(nèi)復(fù)制的HCV株可持續(xù)存在〔25〕。Fujii等〔26〕利用PCR-SSCP法，對(duì)11例慢性丙肝患者血清及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的HVR1準(zhǔn)種株進(jìn)行了比較研究后，發(fā)現(xiàn)有4例(36%)血清及PBMC中的HVR1準(zhǔn)種株序列變異是一致的，2例(18%)HVR1準(zhǔn)種株群體和序列變異均不同，另5例(45%)既未出現(xiàn)準(zhǔn)種株群體改變亦末現(xiàn)HVR1序列變異。提示HCV感染者血清及PBMC中有不同準(zhǔn)種株存在，而血清中HVR1準(zhǔn)種株明顯多于PBMC可能因?yàn)楸┞队谒拗髅庖叩腜BMC相對(duì)不如肝組織，從而產(chǎn)生免疫壓力差異所致。Cabot等〔22〕收集了39例HCV1b型感染的不同病情的患者的肝組織，通過對(duì)其與血清中HCV E2-NS2段核苷酸和氨基酸復(fù)雜性比較，發(fā)現(xiàn)95%的患者相應(yīng)的氨基酸序列是一致的;有26%的患者HCV準(zhǔn)種復(fù)雜性血清中高于肝組織，28%的患者低于肝組織，41%的患者兩者相同，同樣認(rèn)為可能與病毒在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和血漿中循環(huán)的選擇性壓力不同有關(guān)。早些時(shí)候Maggi等〔27〕研究比較了10例丙肝患者肝組織、PBMC及血漿中HCV E2/NS1區(qū)準(zhǔn)種株的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有患者肝組織及PBMC中HCV準(zhǔn)種株有明顯不同。盡管在血漿中有肯定的HCV突變株存在，但存在于肝組織和/或PBMC中的突變株并未在相應(yīng)的血漿中檢測(cè)到;另外，亦末發(fā)現(xiàn)明顯的特異性嗜組織株。而最近Laskus等〔9〕研究則認(rèn)為各種組織和PBMC可選擇性吸附E2區(qū)不同的病毒亞群，從而影響到準(zhǔn)種分布。

　　綜上所述，盡管HCV準(zhǔn)種株現(xiàn)象己經(jīng)得到肯定，但為了更好地掌握HCV在體內(nèi)的變異情況，其量化方法應(yīng)更進(jìn)一步完善和標(biāo)準(zhǔn)化。由于它決定著HCV某些重要的生物學(xué)特性，有必要建立有效的細(xì)胞和動(dòng)物 HCV感染模型，進(jìn)一步明確優(yōu)勢(shì)株與劣勢(shì)株之間關(guān)系及其分布差異的重要意義。我們相信，隨著對(duì)HCV變異和準(zhǔn)種株的深入研究，必然會(huì)給臨床HCV感染的有效防治帶來希望。

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