平滑肌細胞培養方法
貼壁法原代培養
1.1 細胞培養
1.1.1 培養液配制 DMEM（美國Gibco公司），Hepes（15mmol/L），青霉素（100u/ml），鏈霉素（100mg/ml），優質胎牛血清（原代培養濃度20%，傳代培養濃度10%，美國Hyclone）。
1.1.2 培養器皿 25cm2塑料培養瓶（Costar），培養面積25cm2；直徑3.5cm培養皿。
1.1.3 大鼠血管平滑肌細胞培養 動物來源：健康Wistar大鼠，由第三軍大學實驗動物中心提供，雌雄不拘，體重150~180g。動脈取材：斷頸法處死Wis-tar大鼠，無菌條件下分離全段主動脈，立即置于含青霉素100u/ml，鏈霉素100mg/ml的無菌生理鹽水中。每次取材2~3只大鼠。貼壁法原代培養：超凈工作臺上，清除結締組織，剝除動脈外膜?？v向剖開血管，用眼科彎鑷鈍性刮除內膜面，以去除內皮細胞，剩余血管中膜組織較薄、透明、韌性好。用含青、鏈霉素的生理鹽水反復沖洗，去除脂滴、血凝塊等雜質及可能殘留的內皮細胞和外膜成纖維細胞，然后將一次取材的2~3條血管的中膜組織混合在一起，置于無菌培養皿中。滴加少許培養液使組織保持濕潤，用眼科彎剪反復剪切成1mm×1mm大小的組織塊。并剪切好的組織小塊均勻擺置于瓶底，組織塊間距0.5cm。蓋好瓶蓋，輕輕翻轉培養瓶，讓瓶底朝上并向瓶內注入適量培養液，于37℃孵箱內放置2~4h使組織塊干涸并與瓶壁貼附后，將培養瓶慢慢翻轉平放，使組織塊完全浸入培養液中，繼續靜置培養3~5d。待有細胞從組織塊周圍游出后換液。
1.1.4 原代培養動脈VSMC的傳代培養 當大部分組織塊長出細胞暈，并與相鄰細胞的細胞暈接觸時即可傳代。加入配制好的消化液使其恰好覆蓋細胞表面，室溫下大約1~2min，倒置顯微鏡下見細胞質回縮、細胞間隙增大時迅速翻轉培養瓶使細胞脫離消化液，吸棄消化液，加入含胎牛血清培養液3~4ml終止消化并反復吹打瓶壁細胞使細胞脫壁，分散為單細胞懸液。將細胞懸液一分為二接種到新的培養瓶中，補足培養液（每瓶3~4ml）。未消失的組織塊會隨細胞換液、傳代而除去。
1.3 培養細胞的鑒定
1.3.1 形態學 用相差顯微鏡常規觀察細胞生長形態及生長規律，并依常規制作電鏡標本進行觀察。
1.3.2 免疫組織化學鑒定 特異性鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白單克隆抗體（福建邁新生物技術公司），采用SP法對細胞爬片進行免疫組織化學染色。（α-SM-actin免疫組織化學鑒定）
胰酶消化法培養平滑肌細胞
1.1 試劑和動物
胰酶購自Sigma公司；α-actin抗體購自中山生物技術有限公司；PBS液各成分均為市售分析純；新生小牛血清購自HyClone；DMEM為Gibco產品。雄性Wistar大鼠（2只，體重175±25 g）購自中國醫學科學院實驗動物中心。
1.2 胰酶消化法原代培養
Wistar大鼠處死，迅速取出胸主動脈，浸泡在含無菌PBS的表面皿中，轉移到無菌超凈臺。在表面皿中漂洗主動脈去除殘留的血跡，縱向剪開主動脈，把主動脈鋪平并使內膜朝上，用鑷子來回刮除內膜層，剝離血管中膜。將剝離的血管中膜用眼科剪剪碎，碎片大小在1 mm×1 mm左右。裝入含0.25%胰酶的玻璃培養瓶中于37℃條件下消化。當在顯微鏡下觀察組織塊表面出現大量細胞時應立即加入血清終止消化，一般消化的時間在3.5 h。終止消化后將玻璃培養瓶置于37℃空氣搖床振搖10 min，繼續用吹打的方法使組織塊表面的細胞盡可能脫落。待細胞從組織塊脫離后，120目細胞篩過濾，轉入離心管內離心，棄上清，用含20%小牛血清的DMEM培養基吹打細胞，最后接種于25 mL培養瓶，放入CO2孵箱培養，48 h后換液。
1.3 傳代培養
細胞融合后，倒去舊的培養液，加入適量的0.25%胰酶，顯微鏡下觀察，見細胞收縮后去除消化液，加入適量培養液，吹打細胞，以1∶2接種于新培養瓶中，補足培養液，放入37℃、5%CO2孵箱培養。傳代細胞從第三代開始可換用含10%小牛血清的DMEM培養基培養。VSMC至少可以傳16代以上，并且從第二代開始平滑肌細胞即可凍存。
1.4 動脈平滑肌細胞的鑒定
相差顯微鏡下，細胞未匯合之前多數呈梭形，至匯合后，部分區域細胞束狀排列，呈典型的“峰和谷”狀態。將傳代獲得的平滑肌細胞接種于蓋玻片上，3~4天后至亞匯合狀態，取出細胞爬片，PBS清洗后用4℃純丙酮固定15~30 min，自然晾干。采用小鼠抗大鼠α-肌動蛋白抗體免疫組織化學染色鑒定VSMC肌動蛋白。根據S-P免疫組織化學染色的常規方法，以平滑肌細胞胞漿棕黃色為陽性結果。
北京天優福康生物科技有限公司
官網：http://m.jyzjsd.com/
服務熱線：400-860-6160
聯系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
