動物細胞培養方法

前言

動物細胞培養開始于本世紀初，1962 年其規模開始擴大，發展至今已成為生物、醫學研究和應用中廣泛采用的技術方法，利用動物細胞培養生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，已成為醫藥生物高技術產業的重要部分。利用動物細胞培養技術生產的生物制品已占世界生物高技術產品市場份額的50% 。動物細胞大規模培養技術是生物技術制藥中非常重要的環節。目前，動物細胞有懸浮培養和貼壁培養，技術水平的提高主要集中在培養規模的進一步擴大、優化細胞培養環境、改變細胞特性、提高產品的產率與保證其質量上。

動物細胞的特點及生長特性

動物細胞雖可像微生物細胞一樣，在人工控制條件的生物反應器中進行大規模培養, 但其細胞結構和培養特性與微生物細胞相比，有顯著差別：

①動物細胞比微生物細胞大得多，無細胞壁，機械強度低，對剪切力敏感，適應環境能力差；

②倍增時間長，生長緩慢，易受微生物污染，培養時須用抗生素；

③培養過程需氧量少（氧傳質系數kLa 大于10 h - 1即可滿足每毫升107 個細胞的生長）；

④培養過程中細胞相互粘連以集群形式存在；

⑤原代培養細胞一般繁殖50 代即退化死亡；⑥代謝產物具有生物活性，生產成本高，但附加值也高。

一、固定化動物細胞大規模培養技術

1.　固定化培養方法

在動物細胞培養中，培養細胞的目的不僅僅要求催化活力，更重要的是利用細胞來合成和分泌蛋白，因此如何保持細胞的活性顯得尤為重要。由于動物細胞的極度敏感性，上述這些固定化方法會對動物細胞產生毒性，另外多糖（如卡拉膠等） 由于具有很高的離子強度也會對細胞產生毒害。故在動物細胞培養中要考慮使用較溫和的固定化方法，如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化。

1. 1 　吸附

1. 1. 1 　多孔陶瓷

美國某公司開發了一種完全自動化的細胞培養系統。該系統的核心是陶質矩形蜂窩狀生物反應器。反應器構型是一圓筒內裝置有許多陶質矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供4. 25 m2 的生長表面積。既可用于培養懸浮生長的細胞，又可用于培養貼壁依賴性細胞。該系統可以連續化生產蛋白質。由于產物直接分泌到培養基中，給分離純化帶來方便。而且細胞不用從培養基中分離，所以不必考慮梯度問題；當培養基高速循環時，可以保持相對恒定的營養物和氧濃度。增加套數即可實現放大。

1. 1. 2 　微載體

微載體細胞培養法是一種用于培養錨地依賴性細胞的大規模培養技術。這種培養技術是在生物反應器內加入培養液和一種對細胞無毒害作用的材料支撐的顆粒（微載體），使細胞在微載體表面附著和生長，并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態。培養液中大量的微載體為細胞提供了極大的附著表面，1 g 微載體其比表面積可達6 000 cm2 ，從而可實現細胞的高密度培養。

微載體的直徑在60～250μm ，由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細胞的粘附特性，在其表面帶有大量電荷及其他生長基質物質，因而有利于細胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養具有以下優點：

①比表面積大，單位體積培養液的細胞產率高；

②采用均勻懸浮養，無營養物或產物梯度；

③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況；

④細胞收獲過程相對簡單，勞動強度?。?/span>

⑤培養基利用率高，占地面積?。?/span>

⑥放大容易，國外已有公司以1 000 L 規模培養人的二倍體細胞來生產β- 干擾素。但其缺點是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細胞；接種密度高，微載體吸附力弱，不適合培養懸浮型細胞。

1. 1. 3 　大孔微載體

人們為了解決微載體培養系統中細胞易受機械損傷的缺陷以及能最大限度地擴大比表面積, 開發了具有完全連通溝回的大孔微載體。大孔微載體將細胞固定在孔內生長，因而與其他方法相比具有一系列優點：

①比表面積大,是實心微載體的幾倍甚至幾十倍；

②細胞在孔內生長，受到保護，剪切損傷小；

③與包埋法相比，傳質尤其是傳氧效果好；

④兩種類型細胞都適用；

⑤細胞三維生長，細胞密度是實心微載體的10 倍以上，有的可達108 個/ mL；

⑥適用于長期維持培養,細胞生長情況依然良好；

⑦微載體濃度高，實心載體在培養液中濃度增大到一定時，細胞密度反而下降；而大孔微載體在濃度較高時，表面碰撞增加，能促使細胞在孔內生長；

⑧最適合于蛋白質生產和產物分泌。因此有人預言，大孔微載體技術將成為動物細胞大規模培養的一種常用方式。

1. 2 　包埋

將動物細胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡便，條件溫和，負荷量大，細胞泄露少。因細胞嵌入在高聚物網格中而受到保護，細胞能抗機械剪切。但該法也有一定缺點，如擴散限制，并非所有細胞都處于最佳營養物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴型細胞的固定化。多孔凝膠是最常用的載體，用于動物細胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。

1. 2. 1 　海藻酸鈣凝膠

海藻酸鈣凝膠包埋法是將動物細胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1 mm 內含動物細胞的海藻酸鈣膠珠，分離洗滌后即可用于培養。此法操作時條件溫和，對活細胞損傷小。但固定后機械強度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細胞，國外已有專門的振動噴嘴設備可供使用。

1. 2. 2 　瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細胞的瓊脂糖溶液分散到一個水不溶相中(如石蠟油) ，形成直徑0. 2 mm 凝膠珠珠, 移去石蠟油后, 細胞即可進行培養。同海藻鈣一樣，瓊脂糖更適于培養懸浮細胞。盡管凝膠珠形成過程很復雜，目前放大體積不超過20 L 。但瓊脂糖凝膠無毒性，具有較大的空隙，可以允許大分子物質自由擴散，因此該法特別適用于蛋白產物的連續生產。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細胞和淋巴細胞生產單克隆抗體和白細胞介素 。

1. 2. 3 　血纖維蛋白

將動物細胞與血纖維蛋白原混合，然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉化為不溶性的血纖維蛋白，將動物細胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進細胞貼壁，因此兩種類型的細胞都適于培養。而且基質高度多孔，允許大分子物質的自由擴散。但機械強度差，對剪切力很敏感。

1. 3 　中空纖維

中空纖維細胞培養技術是模擬細胞在體內生長的三維狀態，利用一種人工的“毛細管”即中空纖維給培養的細胞提供物質代謝條件而建立的一種體外培養系統。典型的封閉中空纖維如下圖：

中空纖維培養技術的優點是無剪切、高傳質、營養成分的選擇性滲入，使培養細胞和產物密度都可達到比較高的水平。缺點是膜的污染和堵塞，觀察困難，細胞生長或過量氣體產生會破壞纖維。中空纖維培養技術的發展趨勢是讓細胞在管束外空間生長，以達到更高的細胞培養密度。目前中空纖維反應器已進入工業化生產，主要用于培養雜交瘤細胞來生產單克隆抗體。

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