淋巴細胞培養注意事項

一、嚴格無菌操作　

對實驗室以及培養過程中所接觸的試劑、液體、器皿、儀器的消毒,均應嚴格按照有關細胞培養的參考書的要求進行操作。無菌觀念要貫穿整個實驗的始終,不可松懈。

二、培養器皿的選擇　

淋巴細胞培養既可選擇培養板(24 、48 、96 孔) 、培養瓶,也可選擇三角燒瓶、試管等器皿進行培養。有研究表明提取的淋巴細胞用1. 5ml 離心管培養72 小時,細胞生長狀況良好,細胞數與培養前比較,差異無統計學意義( P >0. 05) 。用青霉素小瓶進行培養,淋巴細胞生長也非常好。

可以認為,對散在的細胞培養來說,用小器皿具有以下優點:

(1) 便于操作:1. 5ml 離心管為一次性使用,青霉素小瓶可反復刷洗,而培養板、培養瓶價格偏貴且用過幾次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更為重要的是,淋巴細胞培養為懸浮培養,在培養過程中需要不斷晃動,而大多數實驗室沒有恒溫搖床。我們發現,在培養過程中每隔6～8小時晃動一次培養器皿,便可解決這個問題。青霉素小瓶、1. 5ml 離心管晃動起來相對容易些。

(2) 減少污染:因為淋巴細胞培養的液體量較少,一般為100～ 200μl , 故文獻資料中多見用培養板( 48 、96孔) ,少見用培養瓶。對分散的淋巴細胞培養,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培養也失敗。而且,晃動培養板時,很容易使液體濺到培養板蓋上,增加污染的機會。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 離心管等小器皿便可避免這些現象,但缺點是不易觀察細胞生長,需取樣加到載玻片上觀察。

三、血清的選擇

淋巴細胞對血清的要求較高,所以選用血清時要注意生產廠家。但胎牛血清價格昂貴,新生小牛血清或小牛血清也價格不菲,而使用自身血清不僅細胞長得好,而且更接近體內環境,避免了外來因素的干擾,使實驗設計更嚴密。血清濃度在5 %～20 %時細胞生長比較好,當超過30 %時反而不利于細胞生長。

四、pH 值

細胞生長的最適pH 為7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范圍為6. 6～7. 8 ,當pH 低于6. 8 或大于7. 6 時, 都會抑制細胞生長 。 RPMI1640 培養基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培養液及其他用液時使pH 值達到7. 2比較合適,并且需經常檢測pH 值。

五、培養空間

培養液與液面上的空間二者的體積比例一般以1∶10 為宜,培養液液面高度最好維持在2～5mm 的范圍,以便于氣體交換 。

六、恒溫培養箱

溫度應維持在37 ℃,CO2 濃度為5 % ,O2 為95 % ,100 %的飽和濕度。

七、常見失敗原因　

1.　污染　

污染仍是細胞培養失敗的主要原因,包括細菌和真菌,中藥制劑尤易出現真菌污染。支原體污染不易發覺,但對細胞生長影響較小,尤其只培養72 小時。一般是分離過程中的用液和培養基出現了污染。

2.　pH 值　過高或過低,或培養過程中瓶塞不緊,CO2 逸出,導致pH 值上升。

3.　誘導劑 淋巴細胞在體內外一般是不分裂的,在培養過程中須添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS) 、白細胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、絲裂霉素等促分裂劑和抗原物質。須注意它們的濃度及是否失效。

4.　培養器皿洗滌不干凈　有蠟、油污或酸殘留。

5.　培養用液含有雜質　配制過程中所使用的各種溶液必須用三蒸水,若含有Fe 、Ca 等離子及雜質,可影響細胞的增殖 。

6.　接種的細胞數目過多或過少,或提取的淋巴細胞中混有大量紅細胞 。

7.　血清質量不佳。

8.　恒溫培養箱的CO2 、溫度等不穩定。

9.　存在個體差異　在相同條件下,某一受試者的血培養不成功,而對照實驗培養結果正常,其原因有時無法查出.淋巴細胞的生長情況,還與受試對象的年齡有關,青年人的淋巴細胞比中、老年人的生長得要好。

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