Marc 145細胞培養和維持有關資料綜述
一、 細胞及培養
1、Marc145細胞
上皮樣細胞，來源于猴腎細胞，從母細胞（MA 104細胞）克隆而得到，可連續培養。
2、生長培養基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉）＋5－10％新生牛血清+ 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養液。
3、凍存液
生長培養基＋10% DMSO
4、細胞健康生長的幾項注意事項
（1）細胞沒有支原體等外源因子的感染。
（2）培養液的pH值可在7.0－7.3，以7.2為佳。
（3）一般按1：3傳代，細胞接種密度為1－1.5×105cells/ml，48hr后長成單層。
（4）培養基和血清的質量可靠、穩定；建議采用特級小牛血清。
（5）細胞及時傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長成細胞單層時進行傳代、擴增。
（6）細胞傳代時消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化過程應盡量縮短在1～2分鐘內完成。
二、 病毒感染、維持和收獲
轉瓶中細胞長成單層后，棄瓶內細胞生長液，接種PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入維持液，置37℃恒溫室轉瓶機上旋轉培養3－5天。
維持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH應為7.4～7.8；后期維持pH會慢慢降下來。
細胞病變時間出現在接毒后48小時，72～96小時細胞病變達80％左右，當細胞出現80%以上病變（CPE）時，即可開始收毒；反復傳過幾代后病變時間可縮短。
第3、4天注意觀察，細胞病變（CPE）達到80％時收獲病毒，－20℃凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測定TCID50。
收液時需要將含毒細胞反復凍融2～3次以破碎細胞，將病毒釋放到培養液中。
三、 細胞病變（CPE）
細胞在接種病毒后，24－48hr開始出現病變，72－96hr約達到80％病變。病變現象：細胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，最后整個細胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現細胞病變的Marc 145細胞。
四、 PRRS病毒在細胞中增殖規律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145細胞過程可大致分為兩個感染階段，第一階段：病毒感染細胞后的20－22hr左右，僅部分細胞被隨機感染，而且Marc 145細胞對PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無關，因為MOI劑量比常規量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細胞呈PRRSV陽性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的2－3天（也稱為病毒的對數感染期），病毒感染蔓延是通過相鄰細胞和細胞之間的接觸感染，細胞對自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現了感染細胞群。
對我們的一點啟示：可以采用適當低量的MOI進行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時，大部分細胞在維持期的第一天尚需繼續生長，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，較長的病毒維持期均需要供給豐富的營養物資，可以相信：維持液的營養成分對病毒增殖效率有非常重要的影響。
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