原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系(一)

細(xì)胞的來(lái)源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來(lái)源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長(zhǎng)傳至10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開(kāi)展單細(xì)胞克隆、純化，經(jīng)大量擴(kuò)增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞。此過(guò)程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù)，才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法，本章重點(diǎn)敘述常用的基本技術(shù)。

第一節(jié) 原代細(xì)胞的取材

人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件，是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的第一步，若取材不當(dāng)，將會(huì)直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)，現(xiàn)將取材的基本要求和注意事項(xiàng)敘述如下：

一、取材的基本要求

（1）取材要注意新鮮和保鮮 新鮮組織易于培養(yǎng)成功，取材時(shí)應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細(xì)胞，盡快入箱培養(yǎng)，若不能即時(shí)培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，于4℃存放。若組織塊較大，應(yīng)在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放，但時(shí)間不能超過(guò)24h.對(duì)于已切碎的組織或血液、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基，按細(xì)胞凍存方式于液氮中冷凍保存。

（2）取材應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌 所取標(biāo)本材料應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，為了確保無(wú)菌，對(duì)所取材料若疑有污染的可能，應(yīng)將所取組織在含高濃度抗菌素（400單位/mL）甚至加入適量的兩性霉素B或10%達(dá)克寧液的培養(yǎng)液內(nèi)于4℃下存放2小時(shí)以上，再用PBS洗2~3次，以確保所取材料無(wú)菌。要用無(wú)菌包裝的器皿或事先消毒好的帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含400單位/mL抗菌素）的小瓶等便于攜帶的物品來(lái)取材，所取材料應(yīng)避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì)，如碘、汞等。

（3）取材和原代細(xì)胞制作時(shí)，要用鋒利的器械，如手術(shù)刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。

（4）要仔細(xì)去除所取材料上的血液（血塊）、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織，切碎組織時(shí)應(yīng)避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。

（5）取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等，一般來(lái)講，胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長(zhǎng)，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。取材時(shí)應(yīng)盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。

（6）原代細(xì)胞取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對(duì)組織的來(lái)源、部位、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄，以備以后查詢。

二、各類組織的取材技術(shù)

（一） 皮膚和粘膜的取材

皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來(lái)源，主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作，但面積一般2~4cm2即可，這樣局部不留疤痕，若對(duì)燒傷皮膚進(jìn)行上皮細(xì)胞膜片移植，可從大腿或臀部取較大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材時(shí)不要用碘酒消毒；若培養(yǎng)上皮細(xì)胞，取材時(shí)不要切取太厚，盡可能去除所攜帶的皮下或粘膜下組織；若欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，則反之。皮膚粘膜與外界相通部位，因表面細(xì)菌、霉菌很多，取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格消毒，必要時(shí)要用高濃度抗菌素和適量?jī)尚悦顾谺漂洗、浸泡。

（二）內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開(kāi)破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織，否則培養(yǎng)后，由于成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)給以后的培養(yǎng)工作增加困難。對(duì)于一些特殊細(xì)胞培養(yǎng)的取材，詳見(jiàn)后面有關(guān)章節(jié)。

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