樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)操作步驟
準(zhǔn)備補(bǔ)充劑
將補(bǔ)充劑混合物在 15~25℃ 解凍。在無(wú)菌條件下用移液槍小心地將補(bǔ)充劑混合物混勻。然后，把補(bǔ)充劑混合物全部加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。蓋上瓶子，輕輕混勻直到形成均一的混合物。DC生成培養(yǎng)基所附帶的相應(yīng)的細(xì)胞因子組合包含有成分A和B，它們都是以100X 的原液狀態(tài)運(yùn)輸?shù)摹?/span>
注意：此時(shí)不要將化合物B加入培養(yǎng)基中。
DC基礎(chǔ)培養(yǎng)基不帶細(xì)胞因子，因此使用時(shí)必須另外自行添加。
新鮮分離的單核 DC 細(xì)胞的傳代
對(duì)于新鮮分離自外周血單核細(xì)胞或者單個(gè)核細(xì)胞的單核樹突狀細(xì)胞的傳代 ，P romoCell 建議使用樹突狀細(xì)胞生成培養(yǎng)基 DXF（C-28052）。詳情如下：
1、使細(xì)胞附著（第 0 天）
新分離的細(xì)胞接種到適量的 PromoCell DC 生成培養(yǎng)基DXF中（不含細(xì)胞因子）。單核細(xì)胞的接種密度為200-300萬(wàn)/cm2，純化的單核細(xì)胞則為50萬(wàn)/cm2。在37℃和5%的CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)。
2、清洗附著的細(xì)胞（第 0 天）
用力晃組織培養(yǎng)皿使未附著的細(xì)胞脫落并吸去。用溫?zé)岬?PromoCell DC 生成培養(yǎng)基 DXF（不含細(xì)胞因子）洗三次， 吸走 上清液。
3、開(kāi)始分化為不成熟的單核 DC 細(xì)胞（第 0 天）
加入適量的混有 1x 化合物 A 的 P romoCell DC 生成培養(yǎng)基 DXF，在 37 ℃和 5 %的 CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
4、更換培養(yǎng)基（第 3 天）
在第3天的時(shí)候更換 培養(yǎng)基：從細(xì)胞中吸走培養(yǎng)基，收集在一個(gè)離心管中。然后立刻吸取新鮮的與1x化合物A混合的DC生成培養(yǎng)基DXF加入到細(xì)胞中。在 180g 的離心力條件下離心10分鐘。棄去上清液，然后小心地用少量新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將離心管中的重懸的細(xì)胞和組織培養(yǎng)皿 中的新鮮培養(yǎng)基中的細(xì)胞混合。將未成熟的單核 DC 細(xì)胞在 37℃ 和 5%的 CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng) 3 天。
注意：附著的松散附著的和未附著的細(xì)胞在這一階段都能看見(jiàn)。未成熟的細(xì)胞，也稱為含蓄的細(xì)胞，它們的外觀看起來(lái)是不規(guī)側(cè)的樹干狀的細(xì)胞，偶爾有大型的細(xì)胞質(zhì)突起。它們呈現(xiàn) CD45+/CD83-的表現(xiàn)型，對(duì) CD14 染色顯示陰性至弱陽(yáng)性。
5、完成單核 DC 細(xì)胞的成熟過(guò)程（第 6 天）
第6天在培養(yǎng)后的培養(yǎng)基中加入適量化合物B原液（混合后化合物B的終濃度為1x）以完成單核DC細(xì)胞的成熟過(guò)程。不要更換培養(yǎng)基，在37℃和5%的 CO2的培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)24-48小時(shí)。
6、收獲成熟的單核 DC 細(xì)胞（第 7/8 天）
反復(fù)上下吹洗幾次以吹打松散附著的細(xì)胞。將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到 50ml 的離心管中。用180g 的離心條件下將收貨的單核 DC 細(xì)胞離心10分鐘，棄去上清液。
注意：成熟的單核 DC 細(xì)胞都是非貼壁細(xì)胞，由于他們有多個(gè)螺旋狀樹突，而表現(xiàn)出奇特的形態(tài)。
7、進(jìn)行您的工作
重懸并計(jì)算細(xì)胞，您現(xiàn)在可以用單核DC細(xì)胞進(jìn)行下一步的工作。另外，可以用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD14，CD45 和 CD83 來(lái)驗(yàn)證樹突狀細(xì)胞的免疫表現(xiàn)型。
注意：使用混合有細(xì)胞因子包的 PromoCell 的 DC 生成培養(yǎng) 基DXF傳代得到的成熟單核 DC 細(xì)胞的表面抗原形態(tài)為 CD14-/CD45+/CD83+。
相對(duì)應(yīng)細(xì)胞形態(tài)一覽表
DC的主要特點(diǎn)：
? 不需要磁珠等復(fù)雜方式分離提純血細(xì)胞
? 細(xì)胞誘導(dǎo)增殖速度快，整個(gè)過(guò)程僅需7-8天
? 操作過(guò)程簡(jiǎn)單，只要嚴(yán)格操作就能拿到最好的誘導(dǎo)效果
? 既可以培養(yǎng)新鮮分離的單核細(xì)胞，也能適用于凍存的單核細(xì)胞
? 共有三種方案可以實(shí)現(xiàn)單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞的轉(zhuǎn)變
? 無(wú)血清，無(wú)動(dòng)物源性，化學(xué)成分確定
? 誘導(dǎo)效果確切
DC的優(yōu)點(diǎn)：
? 使用成本低，操作簡(jiǎn)單
? 降低污染風(fēng)險(xiǎn)
? 批間差異最小化
? 血清的影響最小化
? 可以輕松地實(shí)現(xiàn)在體外從單核細(xì)胞得到樹突 狀細(xì)胞
? 誘導(dǎo)效率高
? 細(xì)胞誘導(dǎo)效果確切
PromoCell DC DXF 產(chǎn)品和同類產(chǎn)品相比較
PromoCell的DC細(xì)胞生成培養(yǎng)基和市面上其他的培養(yǎng)基想比，在 同等培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞供體情況下，其培養(yǎng)效率為競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的5倍。
Fig.:Comparison of moDC yield.Freshly isolated peripheral blood monocytes were cultured for 10 days in the respective media. Each of the media was supplemented with the PromoCell cytokine Pack moDC DXF.
使用PromoCell DC生成介質(zhì)為樹突狀細(xì)胞的生成DXF有什么優(yōu)勢(shì)？
DC DXF（C-28052）是一種無(wú)血清，化學(xué)定義的不含動(dòng)物來(lái)源的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。它提供了一個(gè)完整的培養(yǎng)系統(tǒng) （即用型，包括所有細(xì)胞因子），在體外即可誘導(dǎo)新鮮分離的外周血單核細(xì)胞又可誘導(dǎo)凍存細(xì)胞，在DC細(xì)胞的誘導(dǎo)上顯示了高效性，重復(fù)性 好的卓越性能。
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