胚胎干細胞培養(yǎng)標準化操作規(guī)程(SOP)

一、細胞

多能性胚胎干細胞產(chǎn)生于小鼠胚泡

1．表達綠色熒光蛋白（EGFP）的B5-ES細胞。由Dr. Nagy的實驗室制備。

2．D3-ATCC; CRL-1934. 我們得到時大約傳了17代。

3．J1-由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。我們得到時大約傳了7－9代。

4．J1rtTA-rtTA表達J1細胞，由Dr. Jaenish的實驗室友情提供。

5．表達黃色熒光蛋白的YC5-ES細胞，由Dr. Nagy的實驗室提供。

二、一般培養(yǎng)——維持ES細胞處于未分化狀態(tài)

ES細胞培養(yǎng)用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培養(yǎng)基來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質(zhì)。建議每2－3天從達到 80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養(yǎng)皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經(jīng)過包被的組織培養(yǎng)板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養(yǎng)。

培養(yǎng)基

ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（該溶液也能用于EB培養(yǎng)基--見下文）。分裝在50ml FALCON管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

貯存液

DMEM(高糖)
馬血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO

復蘇細胞

細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結(jié)晶的形成，結(jié)晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

步驟

1．從液氮中取出一管細胞；

2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內(nèi)溶液恰好完全溶解）；

3．將細胞轉(zhuǎn)移到一15ml Falcon管中；

4．加入5ml ES培養(yǎng)基（用培養(yǎng)基沖洗凍存管）；

5．離心3分鐘；

6．棄上清，用2ml ES培養(yǎng)基重懸細胞，至少吹打10次；

7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養(yǎng)皿；

8．孵育。

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