大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的重要成分，與外周血管內(nèi)皮細(xì)胞不同，它具有高跨內(nèi)皮阻抗（transendothelial electrical resistance，TER）、細(xì)胞間緊密連接、極少的胞飲小泡、缺乏窗孔結(jié)構(gòu)以及含有選擇性雙向跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等獨(dú)有的特征，從而使血腦屏障形成一個(gè)限制大多數(shù)極性分子和蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)的選擇性低滲透性的屏障[1]。由于體外培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞保持了較多的其體內(nèi)固有的特點(diǎn)[1]，因此目前腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)模型已被廣泛應(yīng)用于血腦屏障的研究、腦血管疾病的病理生理及分子生物學(xué)研究、新藥篩選、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞生理生化及藥理學(xué)研究等領(lǐng)域。而大多數(shù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用大鼠為動(dòng)物模型，而且大鼠具有較多的細(xì)胞生物學(xué)研究所需的抗體可用，因此進(jìn)行大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)具有重要的意義。自從Panula等[2]首次成功培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞以來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法已有較多的報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)的方法多以組織勻漿、兩次尼龍網(wǎng)過(guò)濾分離腦微血管段為主[3,4]，也有采用酶消化、梯度離心及尼龍網(wǎng)過(guò)濾的[5]，但細(xì)胞得率均較低，而近些年來(lái)國(guó)外大多數(shù)方法采用以大腦皮質(zhì)為材料、酶消化及梯度離心分離腦微血管段并進(jìn)行原代培養(yǎng)[6~9,11,12]。由于原代培養(yǎng)中無(wú)法避免地混雜成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞等其他細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且工作量大、過(guò)程繁瑣且費(fèi)用高[1]，進(jìn)行較純的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代培養(yǎng)一直是國(guó)內(nèi)外的一個(gè)難點(diǎn)。

本人參照文獻(xiàn)[6]、[7]、[8]的方法，成功地摸索出大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)的方法，并獲得純度較高的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

每次實(shí)驗(yàn)采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。

1.2 試劑

纖連蛋白（fibronectin），Ⅳ型膠原，鼠尾膠，葡聚糖（dextran，分子量100~200kDa），DNA酶Ⅰ（DNaseⅠ）購(gòu)自Sigma公司；D-Hanks液，PBS，10×PBS按配方自制；Ⅱ型膠原酶購(gòu)自Worthington公司；明膠，牛血清白蛋白（BSA），HEPES購(gòu)自Amresco公司；Percoll購(gòu)自Amersham Biosciences；DMEM（高糖）購(gòu)自Gibco BRL公司；肝素鈉，NaHCO3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；青、鏈霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自PAA Laboratories；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），膠原酶/分散酶（collagenase/dispase）購(gòu)自Roche公司。

1.3 重要儀器

低溫離心機(jī)（1 Centrifuge 5810 R，購(gòu)自Eppendorf；2 himac CR 22F，購(gòu)自Hitachi）

1.4 試劑配制

1mg/ml鼠尾膠（用0.2%乙酸配制），1%明膠（用D-Hanks液配制），1%Ⅱ型膠原酶（用DMEM配制，用時(shí)稀釋成0.1%的濃度），1%膠原酶/分散酶（用DMEM配制，用時(shí)稀釋成0.1%），15%葡聚糖（用PBS配制），20%BSA（用DMEM配制，調(diào)pH值至7.4后用0.45 um濾膜過(guò)濾除菌，較難過(guò)濾！），DNase Ⅰ（用冷PBS配制成2 U/ul），以上試劑經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾除菌后分裝保存于-20 ℃；50%Percoll(配12 ml,需6 ml Percoll原液, 0.67 ml 10×PBS, 0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養(yǎng)液（含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 ug/ml），pH值調(diào)至7.4，過(guò)濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時(shí)加入20%FBS，1 ng/ml bFGF。

1.5 培養(yǎng)皿處理

涂布3種不同的基質(zhì)：培養(yǎng)前一天加入1 ml 1%明膠于35mm塑料培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜，接種前用D-Hanks液漂洗2次；接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 ug/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次；50ul 0.1%纖連蛋白、50ul 1 mg/ml Ⅳ型膠原和400ul雙蒸水混合后，加入到每個(gè)培養(yǎng)皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個(gè)培養(yǎng)皿，置于37 ℃培養(yǎng)箱1~2 h晾干后，用D-Hanks液漂洗2次。

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