原代微血管內皮細胞的體外分離培養

原代微血管內皮 細 胞（ Primary Microvascular Endothelial Cells ）的體外分離培養

微血管內皮細胞生長因子的應用和免疫磁珠技術的發展，使微血管內皮細胞的培養和純化變得相對簡化。

1、微血管內皮細胞培養簡述

人體主要器官和組織的微血管內皮細胞已經培養成功的有：骨骼肌、心、腦、胃、視網膜、肺、皮膚、脈絡膜、小腸、脂肪、肝竇、腎、關節滑膜、胎盤、骨髓、胰島、角膜及食道等器官組織的微血管內皮細胞。

2、微血管內皮細胞的分離

目前分離內皮細胞的方法主要有三種，即酶消化法、機械分離法和磁珠分離法。

酶消化法：優點是分離的細胞多、純度較高；缺點是酶對某些蛋白有破壞作用。消化后的組織懸液需要用血清終止酶活性，并將組織懸液通過200目的金屬篩去除未消化組織。

機械分離法和磁珠分離法：可以避免酶對內皮細胞的損傷，缺點是其他細胞的污染可能性較大。

磁珠分離法：利用特異的介質(表面有內皮細胞特異單克隆抗體的磁珠)從其他細胞群中分離出內皮細胞。這種方法雖然可以分離出可用于炎癥研究的微血管內皮細胞，但是分離的細胞量少。

機械分離法：用于大血管內皮細胞的分離，這種方法避免了酶對內皮細胞的損傷和其他細胞的污染。

3、微血管內皮細胞的純化

（1）純化的方法：主要有利用尼龍網或不銹鋼網篩過濾細胞懸液、物理刮除法、生長特性選擇法、局部消化法、差速黏附法和免疫磁珠法等。

（2）生長特性選擇法：根據內皮細胞的生長特性加以分離，即已貼壁的組織塊，培養一段時間后除血細胞外，其他細胞尚未離開組織塊而微血管內皮細胞最先游出，這時立即移去組織塊，所留的大部分是血細胞和內皮細胞，血細胞經傳代1代至2代后自動消除，剩下便是微血管內皮細胞。這種方法由于避免了對細胞的機械和化學損傷，且不需特殊設備，操作簡單，較為可取。

（3）局部消化法：當不同類型的細胞群之間界限明顯時，可在目的細胞區域滴加少量的消化酶，作用一段時間后，將消化液連同細胞吸出，再離心除去消化酶或終止消化后，將細胞接種于另外的培養板孔中進行培養。這種方法同物理刮除法一樣，要求目的細胞的相對數量要大，并且與其他細胞界限相對明顯。

差速黏附法：內皮細胞較成纖維細胞貼壁牢固，用胰酶消化細胞，在倒置顯微鏡下監視，當成纖維細胞收縮變圓脫壁時，立即用含胎牛血清的培養基終止消化，隨后輕輕吸去細胞液，大多數內皮細胞仍然保留在原培養板孔中。經過數次同樣的處理，成纖維細胞基本可以被除去。

4、微血管內皮細胞的鑒定

到目前為止，還沒有發現不同器官組織的微血管內皮細胞具有共同的特異蛋白或標志。

微血管內皮細胞的鑒定：

（1）根據器官和組織的起源，從形態、表型、生化和功能等方面進行綜合評價。

（2）微血管內皮細胞一般呈單層生長，有接觸抑制現象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可以看到Weibel-Palade小體。

（3）表面表達CD31、CD34、凝血調節蛋白、第Ⅷ因子和選擇素等，細胞可攝取低密度脂蛋白，產生前列腺素，內吞功能，結合植物血凝素，形成毛細血管樣網絡。

5、微血管內皮細胞的培養要點

根據微血管內皮細胞的生長特性，需要采用一些特殊的培養條件，并且這些培養條件可能因為微血管內皮細胞的起源不同而有所差異。微血管內皮細胞的培養一般選用基礎培養基、胎牛血清、雙抗、谷氨酰氨、內皮細胞生長因子。

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