肝星狀細(xì)胞培養(yǎng)

材料

相差顯微鏡，熒光顯微鏡，手術(shù)器械，雄性SD大鼠，體重250-450 g，戊巴比妥鈉，200目尼龍網(wǎng)，小牛血清（或胎牛血清，則更好），DMEM，胰酶消化液（以HBSS配），Nycodenz（以GBSS配），D-Hanks'（KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4.7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L），HBSS，臺(tái)盼蘭等。

方法

大鼠腹腔麻醉-->剖腹-->門(mén)靜脈插管-->D-Hanks'液灌注，同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈-->灌以胰酶消化液-->離體肝臟并剪碎-->繼續(xù)消化-->以尼龍網(wǎng)過(guò)濾-->450 g X 5'（4度，下同）-->ppt以HBSS重懸-->混以Nycodenz液-->轉(zhuǎn)至離心管，并覆以HBSS-->1450 g X 16'-->取界面細(xì)胞-->重懸、離心收集細(xì)胞-->細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量-->按照常規(guī)接種-->次日換液。

傳代方法：棄培液-->以D-Hanks'液洗兩次-->0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->鏡下觀察細(xì)胞突起回縮（2-5分鐘左右）-->以完全培液（DMEM+10% NBS）終止反應(yīng)（若不用EDTA，可以不需離心）-->吹打，1:2-1:3接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)（5% CO2，37度）。

結(jié)果

次日，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈星芒狀，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴，熒光鏡下328 nm處見(jiàn)自發(fā)熒光。附上本人發(fā)表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片（見(jiàn)插圖）。

討論

進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和alpha-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。

也采用過(guò)無(wú)須原位消化的方案，完全可行，只不過(guò)消化時(shí)間更難控制！

參考文獻(xiàn)

袁桃霞，張錦生，張?jiān)露穑? 大鼠肝Ito細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1996;23(2):90-93.

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