流式細胞儀檢測外周血樹突狀細胞

樹突狀細胞（DC）的主要功能是吸收抗原，進行加工，并向T淋巴細胞呈遞。其它抗原呈遞細胞也有此功能，如B淋巴細胞和單核細胞。

但是，與其它細胞不同的是，DC細胞具有誘導初發免疫反應的獨特功能，例如，可以活化處女T細胞（Naive T cell）。DC細胞存在于外周淋巴組織中，已在血液和非淋巴器官中發現了不同類型的DC細胞，并被認為是淋巴組織中細胞的前體。

由于血液和組織中DC細胞含量少，且缺乏特異的DC標記物，所以DC細胞的研究非常困難。因此，關于DC細胞的了解主要來自于通過密度梯度離心、培養、和/或陰性選擇富集后的DC細胞的研究。

這些過程利用了DC細胞的密度和黏附特征，和在一定細胞因子條件下的選擇性生長，或缺乏淋巴細胞、單核細胞和粒細胞的系列標記物的表達。但是，這些方法中DC細胞的產率和純度較低，且費時費力。而且，這些操作可以影響細胞的功能，并且無法做DC細胞含量的定量分析。

最近的報告發現在活化DC細胞和血液或淋巴細胞分離培養的DC細胞表面CD83和CMRF-44高表達。

CD83和CMRF-44可以作為DC細胞的活化標志物，但在體內或未處理的細胞上沒有特征性表達，或表達水平很低。在對新鮮分離的DC細胞的研究中，發現IL-3Ra在淋巴器官的DC細胞上有特異表達。從人類外周淋巴組織中分離的單個核細胞中主要是此類DC細胞。

IL-3Ra（CD123）抗體可以用來進行免疫磁珠分選，從外周淋巴組織制備的單個核細胞樣本中，將CD123+ DC細胞進行200倍富集。CD123抗體還可以用來做免疫組化分析，特異識別濾泡外T細胞富集區的CD123+ DC。在外周血中也有CD123+ DC細胞，與以前所說的CD11c- DC細胞和CD33dimCD14-CD16- DC細胞是同一類細胞。

由于缺乏DC特異性標記物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一類細胞。DC細胞既可以由成熟的外周血單核細胞生成，也可以由未分離的CD34+干祖

細胞經GM-CSF和TNF-a培養得到。使用CD123抗體，發現有一群CD34+ DC樣幼稚細胞。這群細胞與CD34+干祖細胞的區別是可以發育成Langerhan細胞樣DC。因此，根據CD123強染，可以識別出一類人類DC細胞，它是不同組織間DC細胞的連接橋梁。

在外周淋巴組織中還發現另一個DC亞群，與CD123+ DC不同的是，其表型為CD11c+HLA-DR+LINdim/-。與CD123+ DC相反，這群DC細胞位于生發中心。在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC細胞，與CD33brightCD14dimCD16- DC細胞是同一類細胞。

由此可見，DC系統由多種細胞類型構成，發育途徑不一。但是，目前對這些細胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理條件下如何受調控等方面仍缺乏了解。

CD123+ DC和CD11c+ DC細胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它們可能有不同的功能。近年來的研究主要集中在使用DC細胞進行抗腫瘤和抗感染治療方面。不同報道證實，這有可能抑制腫瘤生長。

使用這些新的DC標記物建立起來的檢測系統，可以幫助對新鮮外周血新鮮中的兩類不同的DC細胞進行定量檢測，同時可以加以分離。實驗方法采用三色或四色流式細胞儀分析，檢測速度快，樣本用量少，可以用來輔助研究在病理和生理條件下，DC在免疫調控中作用。

檢測原理和用具

檢測原理：

本實驗目的是從外周血中檢測兩種類型的DC細胞：CD123+ DC（Anti-IL-3Ra+）和CD11c+ DC。CD11c和CD123并不是DC特異的標志物。兩類細胞均HLA-DR高表達，單核細胞、淋巴細胞和NK細胞的系列標記物弱表達。

因此使用單一熒光標記的LIN cocktail（LIN1）抗體將DC細胞區分出來。LIN1抗體包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。

另外，本實驗還可以區分嗜堿粒細胞。嗜堿粒細胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。使用HLA-DR可以區分嗜堿粒細胞和CD123+ DC細胞。

細胞來源：

樣本使用EDTA、ACD或肝素鈉抗凝全血，或分離的外周血單個核細胞（PBMC）。樣本采集后24小時內檢測。

試劑：

1. 檢測DC細胞用的BDIS熒光標記的單克隆抗體。

四色分析：

LIN1 FITC：貨號340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56
CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號340545
Anti-HLA-DR PerCP：貨號347364
CD11c APC：貨號340544
Mouse IgG1 PE：貨號349043
Mouse IgG2a APC：貨號340473

三色分析：

LIN1 FITC：貨號340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56
CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：貨號340545
CD11c PE：貨號347637
Anti-HLA-DR PerCP：貨號347364
Mouse IgG1 PE：貨號349043
Mouse IgG2a PE：貨號349053
2. FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，貨號349202，用去離子水1：10稀釋
3. 洗液：PBS緩沖液
4. 1X PBS配制的1%多聚甲醛

設備用具：

1. EDTA、ACD或肝素鈉真空采血管

2. 12′75mm FALCON試管

3. 振蕩混勻器

4. FACS流式細胞儀

5. 離心機

6. 微量加樣器

全血樣本熒光抗體染色步驟：

1. 按照下表在各管中加入適量抗體；

FITC PE PerCP APC
4-Color 四色分析
Tube 1Tube 2LIN1 20uLLIN1 20uL CD123 5u（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1 Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL CD11c 5uLMouse IgG2a
3-Color 三色分析
Tube 1Tube 2Tube 3Tube 4 LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uL CD123 5uL（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2a Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL

2. 每管加入100uL全血，振蕩混勻，室溫暗處反應15分鐘；

3. 加入2mL FACS溶血劑，振蕩混勻，室溫暗處放置10分鐘；

4. 300xg離心5分鐘，棄上清；

5. 振蕩混勻，加入1mL洗液；

6. 300xg離心5分鐘，棄上清；

7. 振蕩混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；

8. 2-8°C暗處保存，24小時內上機分析

PBMC樣本熒光抗體染色步驟：

1. 按照上表在各管中加入適量抗體；

2. 每管加入50uL全血，振蕩混勻，暗處冰浴反應25分鐘；

3. 輕輕混勻，加入1mL洗液；

4. 300xg離心5分鐘，棄上清；

5. 輕輕混勻，加入300uL 1%多聚甲醛；

6. 2-8°C暗處保存，24小時內上機分析

數據獲取：

1. 使用CaliBRITE微球，做FACSComp，調整PMT電壓和熒光補償，檢查儀器靈敏度；

2. 上樣：使用CELLQuest軟件，獲取50,000個細胞，用FSC設閾值，排除碎片干擾；

3. 使用CELLQuest軟件分析結果

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