流式細(xì)胞儀之細(xì)胞凋亡檢測的PI雙染色法
流式細(xì)胞儀是檢測懸浮的單細(xì)胞或微粒的信號分析技術(shù)，被譽(yù)為實(shí)驗(yàn)室的“CT”，可用于細(xì)胞凋亡檢測、細(xì)胞分選、單細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)分析等。這里簡單介紹下流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的兩種方法。
第一部分 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:Heochst 33342/PI雙染色法
一、基本原理
經(jīng)固定的凋亡細(xì)胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降.細(xì)胞一經(jīng)固定就不再是活細(xì)胞,而且細(xì)胞固定過程對細(xì)胞膜的通透性也有影響.因此發(fā)展了用 “細(xì)胞活性”鑒定染料染色的流式細(xì)胞儀檢測方法.這些方法細(xì)胞不經(jīng)固定就直接用DNA染料染色,且染料的濃度要比固定細(xì)胞所用的濃度要低得多.流式細(xì)胞儀通常根據(jù)細(xì)胞膜完整性將細(xì)胞分為“活細(xì)胞”和“死細(xì)胞”,因此正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞歸為活細(xì)胞.活細(xì)胞染料如Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜而對細(xì)胞沒有太大得細(xì)胞毒作用.Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高,Hoechst 33342在凋亡細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度增高的機(jī)制與凋亡細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變有關(guān),凋亡細(xì)胞早期細(xì)胞膜的完整性沒有明顯性改變,但細(xì)胞膜的通透性已有增強(qiáng),因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342比正常細(xì)胞的多.此外,還與凋亡細(xì)胞的染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合以及凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等有關(guān).既然Hoechst 33342進(jìn)入凋亡細(xì)胞中比正常細(xì)胞更容易,而EB、PI或7-AAD等染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞中,即正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞在不經(jīng)固定的情況下對這些染料是拒染,壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損,可被這些染料染色.根據(jù)這些特性,用Hoechst 33342結(jié)合PI或EB等染料對凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色,就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來.在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色(Hoechst 33342++/PI+),壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++).
二、試劑與儀器
1、Heochst 33342 染液：用PBS配成10ug/ml的儲存液濃度,4℃避光保存
2、PI染液：用PBS配成5ug/ml濃度,4℃避光保存
3、400目的篩網(wǎng)
4、流式細(xì)胞儀
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、懸浮生長的細(xì)胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342 ,終濃度為1ug/ml; 37℃孵育7—10min.
2、低溫500 ~ 1000r/min離心5min棄去染液.
3、加入1.0ml PI染液,4℃避光染色15min.
4、400目的篩網(wǎng)過濾1次.
5、流式細(xì)胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光,激發(fā)光波波長為352nm,發(fā)射光波波長為400 ~ 500nm,產(chǎn)生蘭色熒光;PI用氬離子激光激發(fā)熒光,激發(fā)光波波長為488nm,發(fā)射光波波長大于630nm,產(chǎn)生紅色熒光.分析蘭色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖或地形圖.
6、結(jié)果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點(diǎn)圖上,結(jié)果為：正常細(xì)胞為低藍(lán)光/低紅光,凋亡細(xì)胞為高藍(lán)光/低紅光,壞死細(xì)胞為低藍(lán)光/高紅光.
四、注意事項(xiàng)
1、在紅色熒光對蘭色熒光散點(diǎn)圖上,還可見到細(xì)胞凋亡區(qū)向細(xì)胞壞死區(qū)遷移的軌跡,可能是凋亡細(xì)胞的DNA進(jìn)一步降解的緣故.
2、用Heochst 33342染料與細(xì)胞孵育的時間不宜過長,一般控制在20min之內(nèi)為宜.如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光的遷移,導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結(jié)果的判斷.
第二部分 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡——Annexin V/PI雙染色法
一、基本原理
細(xì)胞凋亡
早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,目前早期識別仍有困難.這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使PS暴露在細(xì)胞膜外表面.PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外.Annexin V是一種Ca2+依賴的磷脂結(jié)合蛋白,最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性.對PS有高度的親和性.因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的PS.PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中.兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了.因此,可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測細(xì)胞膜的完整性的檢測方法.
二、試劑與儀器
孵育緩沖液：10mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140mmol/L NaCl,5mmol/L CaCl2
標(biāo)記液：將FITC- Annexin V(寶靈曼公司產(chǎn)品)和PI加入到孵育緩沖液中,終濃度均為1ug/ml
流式細(xì)胞儀
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到10ml的離心管中,每樣本細(xì)胞數(shù)為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min離心5min,棄去培養(yǎng)液.
2、用孵育緩沖液洗滌1次,500~1000r/min離心5min.
3、用100ul的標(biāo)記溶液重懸細(xì)胞,室溫下避光孵育10~15min.
4、500~1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞孵育緩沖液洗1次.
5、加入熒光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min,避光并不時振動.
6、流式細(xì)胞儀分析：
流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488nm,用一波長為515nm的通帶濾器檢測FITC熒光,另一波長大于560nm的濾器檢測PI.
7、結(jié)果判斷：
凋亡細(xì)胞對所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如PI有抗染性,壞死細(xì)胞則不能.細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光,而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生.因此,在細(xì)胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號.正?；罴?xì)胞與此相似.在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細(xì)胞,即壞死細(xì)胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細(xì)胞,顯現(xiàn)(FITC+/PI-).
本文總結(jié)了流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的Heochst 33342/PI雙染色法和Annexin V/PI雙染色法的基本原理、試劑與儀器以及實(shí)驗(yàn)方法和操作步驟。
