值得推薦的血涂片制備及白細胞分類計數方法與步驟
本實驗以魚類的白細胞的實驗材料，主要目的是希望大家掌握血涂片的制作方法，了解白細胞計數方法并依據白細胞形狀的不同進行分類。具體實驗原理、試劑盒器材及操作方法如下：
[目的與原理]
了解各種類型白細胞的形態特征，掌握血涂片制作方法和白細胞分類計數方法，進行不同魚類白細胞分類計數和血細胞形態特征、變形率等的觀察。
白細胞依據其形狀、染色顆粒、細胞質和細胞核的形狀大小可以進行分類。通常的分類方法是根據細胞漿中有無特殊的嗜色顆粒，將其分成顆粒細胞和無顆粒細胞。顆粒細胞又依據所含顆粒對染色劑反應特性，被區分為中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞;無顆粒細胞則分成單核細胞和淋巴細胞。中性粒細胞有較強的吞噬能力，能將侵入機體的微生物消滅掉，并可參與免疫復合物和壞死組織的清除工作。嗜酸性粒細胞的細胞內含有過氧化物酶和酸性磷酸酶，吞噬能力與中性粒細胞相當或稍弱，能吞噬抗原 -抗體復合物，此外，嗜酸性粒細胞具有抗炎作用。嗜堿性粒細胞含有多種化學物質，如組織胺、肝素和5-羥色胺等，當抗原-抗體發生反應時，或機體在寒冷環境中時，都能引起嗜堿性粒細胞釋放組織胺和肝素。血液中的單核細胞穿出血管壁進入組織，變成巨噬細胞，可對抗組織內的致病物，各種細菌和病毒。淋巴細胞有免疫功能，對異己構型的物質具有殺滅和消除作用。
各種白細胞必須經過染色，才易于區分其類別。常用者為瑞氏(Wright’s)染色法和姬姆薩(Giemsa)染色法。
[實驗對象]
魚(淡水魚和海水魚均可)。
[試劑與器材]
試劑：
染色液的配制：
1、姬姆薩(Giemsa)染液的配制
(1)原液配制
Giemsa 粉劑 0.8 g
甘油(醫用) 50 ml
甲醇 50 ml
將Giemsa粉劑溶于甲醇中，在乳缽中充分研磨，溶解后再加甘油，混合均勻，置于37～40℃溫箱內8～12h，過濾，裝入棕色試劑瓶內，密封保存備用。
(2)稀釋液
臨用時取Giemsa原液5ml，加磷酸鹽緩沖液(pH6.4～6.8)50 ml，即為Giemsa稀釋液。
(3)pH6.4~6.8磷酸鹽緩沖液
取磷酸二氫鉀(無水)0.3g，磷酸氫二鈉(無水)0.2g，加少量蒸餾水溶解，調整pH至6.4~6.8，加水至1000ml。
2、 瑞氏(Wright′s)染液的配制
(1)原液配制
瑞氏染料粉劑 0.1g
純甲醇 60 ml
(2) 配制步驟：
① 將瑞氏染料粉放人乳缽內，加少量甲醇研磨。
② 將已溶解的染料倒入潔凈的玻璃瓶內，剩下未溶解的染料再加入少量甲醇進行研磨，如此反復操作，直至全部染料溶解為止。
③ 裝入玻璃瓶內密封，在室溫下保存一周即可使用。
④ 新鮮配制的染料偏堿性，放置后呈酸性，染液儲存時間越久，染色愈好。
器材：
顯微鏡，香柏油，載玻片，蓋玻片，玻片水平支架，采血針或注射器，計數器，小滴管，蠟筆，消毒棉球，瑞氏染液，pH6.4~6.8磷酸鹽緩沖液，姬姆薩染液，蒸餾水。
[實驗步驟]
1、血涂片的制作：取一滴血(采血方法見實驗49)，滴于潔凈無油脂的玻片一端。左手持玻片，右手再取邊緣光滑的另一玻片作為推片。將推片邊緣置于血滴前方，然后向后拉，當與血滴接觸后，血即均勻附在二玻片之間。此后以二玻片約呈30—45度的角度平穩地向前推至玻片另一端(圖1-5-4)。推時角度要一致，用力應均勻，即推出均勻的血膜(血膜不可過厚、過薄)。將制好的血涂片晾干，不可加熱。
2、血涂片的染色步驟：
(1)用蠟筆在血膜兩端各劃一道線，以免染料外溢，置涂片于水平的支架上。
(2)用小滴管將瑞氏染液滴于涂片上，并蓋滿劃出的涂片部分固定約半分鐘。
(3)用小滴管再加1.5倍緩沖液或姬姆薩(Glemsa)染液，輕輕搖動，并輕吹液體使染色液與緩沖液混合均勻，靜置5—10分鐘。
(4)用蒸餾水沖洗(如自來水的pH值穩定于7.2左右時亦可代用)。沖洗血膜時應將玻璃片持平，沖洗后斜置血涂片于空氣中干燥。或先用濾紙吸取水分迅速干燥，即可鏡檢。
3、白細胞分類計數：先用低倍鏡檢查涂片及染色是否均勻。然后加一滴香柏油于血膜厚薄均勻處(一般在體尾交界處)，在油鏡下由此處開始按其形態特征進行分類計數，計數移動時避免重復。根據所見到的100個白細胞，記錄各種白細胞所占的百分數。
例如：嗜中性白細胞分數(%)=計數嗜中性白細胞個數/計數總白細胞個數×100%。
圖1-5-4 血涂片制備示意圖
紅細胞呈桔紅色;中性粒細胞核 為藍紫色，顆粒呈藍紫至紫紅色;嗜酸性粒細胞顆粒呈鮮紅至桔紅色;嗜堿性粒細胞顆粒呈深藍紫色;淋巴細胞核呈深藍紫色，胞質呈天藍色;單核細胞核呈淺紫色，胞質呈灰藍色。
[方法評估]
顯微鏡法白細胞分類是經典、傳統的血細胞分類法，目前還無任何儀器可以完全取代。它能夠準確地根據細胞形態特征進行分類計數，并可及時發現異常細胞。血液分析儀進行細胞分類主要是從細胞的體積大小、細胞核 形、細胞化學染色等方面進行檢測，檢測速度快，分析細胞多，適宜于大批量標本的分析。對其檢測出來的異常標本，要準確識別細胞類別及確認病理改變還必須以顯微鏡檢查為準。
[應用意義]
在不同的生理狀態下，不同種類白細胞數目波動較大。如運動、寒冷、消化期、繁殖期等，此外，在機體失血、劇痛、急性炎癥、慢性炎癥等病理狀態下，白細胞也增多。例如，急性感染、急性中毒、嚴重組 織損傷、惡性腫瘤等中性粒細胞增多;某些病毒、細菌感染、某些慢性感染時，淋巴細胞數量增多。
[注意事項]
1、所用玻片必須干凈，無油污。
2、如染色太淺，可按照原來步驟重染;染色太深或有沉淀物則可用甲醇脫色后重染。
3、如白細胞核 為天藍色則染色時間過短。如紅細胞呈紫紅色，表示染色時間過長。
4、染色時切勿使染液干涸，否則發生不易去掉的沉淀。
5、一定要注意涂片沖洗時不要先傾倒染色，需要先輕輕搖動玻片，緩慢加水使沉渣泛起，最后再用水沖洗，而且沖洗時間不能過長，不然會脫色的。
