大腸桿菌雜交

一、實驗原理

Lederberg和Tatum（1946）選用典型的大腸桿菌為材料，篩選營養(yǎng)缺陷型。利用雙重和三重缺陷型的菌株，在簡單的合成培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)，在此培養(yǎng)基上只有重組子能長，親本不能長，即所謂選擇性培養(yǎng)，使細菌 雜交獲得成功。圖12-1說明了細菌的基因重組是不同基因型的細菌經(jīng)接觸，接合后隨之發(fā)生交換和雜種細菌分離的過程。

大腸桿菌的雜交試驗中發(fā)現(xiàn)有些菌株經(jīng)混合培養(yǎng)能得到重組子，有些卻不能。1952年Hayes做了一個實驗，他所用的二個菌株是菌株A和菌株B。菌株A是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株B是蘇氨酸、亮氨酸和維生素B1的三重缺陷型。Hayes首先篩選鏈霉素抗性突變型ASr和BSr，然后在不含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進行正反雜交，結(jié)果沒有不同，但在含鏈霉素的基本培養(yǎng)基上進行正反雜交，結(jié)果卻不一樣，在ASs×BSr雜交中能得到重組子，可是ASr×BSs雜交中卻并不出現(xiàn)重組菌落。這一現(xiàn)象說明大腸桿菌中有不同的“性”，它與致育因子F有關(guān)。同時按細胞中有無F因子將大腸桿菌分為二類，有F因子的為F+，沒有F因子為F-。F因子是一個小的DNA環(huán)狀分子，分子量約4.5×106道爾頓。帶有F因子的細胞，表面有一種稱為性菌毛的毛狀突起，長約1至20μ。性菌毛上有雄性專一噬菌體（MS2、k17、f2、Qβ等）的吸附位點，又和細胞的接合有關(guān)。F因子在細胞中能以二種狀態(tài)存在；游離狀態(tài)和整合到寄主染色體 的一定位置。以致帶有F因子的大腸桿菌可分為二類：F+和Hfr菌株。經(jīng)吖啶橙處理F+變?yōu)镕-，而Hfr性質(zhì)不變，說明F因子在F+菌株中呈游離狀態(tài)，而在Hfr菌株中則整合到寄主染色體的一定位置（圖12-2）。

大腸桿菌 雜交在F+與F-菌株之間進行，通過細胞的暫時溝通，形成局部合子。在部分合子的形成中，提供部分染色體或少數(shù)基因的菌稱為供體菌，提供整個染色體的菌稱為受體菌；所以F+和Hfr是供體細菌，F(xiàn)-是受體菌。F+和F-能雜交，Hfr和F-也能雜交，F(xiàn)-和F-則不能雜交；但這二個可雜交組合其特性不同，主要表現(xiàn)在：1.Hfr細菌和F-細菌雜交以后F-細菌性質(zhì)不變，F(xiàn)+和F-細菌雜交以后F-細菌轉(zhuǎn)變?yōu)镕+（約70％）。2.F+和F-細菌雜交重組頻率10-6，Hfr和F-細菌雜交重組頻率高出F+菌株幾百倍，稱高頻重組。

在F+與F-雜交中，F(xiàn)因子由F+供體高頻轉(zhuǎn)移到F-受體，低頻轉(zhuǎn)移宿主染色體的標志。原因是F+群體中每個細胞能轉(zhuǎn)移性因子到F-受體，只有小部分細胞能轉(zhuǎn)移染色體的標記。在Hfr與F-雜交中，Hfr供體的染色體由原點（在F因子內(nèi)）開始轉(zhuǎn)移進入受體菌，在這過程中F因子被割裂，F(xiàn)因子基因，一些是首先進入，另一些是最后進入。在這類雜交中只有當交配過程長到足以允許整個供體染色體被轉(zhuǎn)移入F-受體，受體細胞才能由F-變?yōu)镠fr。

雜交實驗有多種不同方法，這里介紹的是直接混合培養(yǎng)和液體培養(yǎng)。直接混合培養(yǎng)法操作簡單，適用于確定二個菌株間能否雜交或測定重組頻率的高低，而液體培養(yǎng)適宜于細菌的基因定位。

二、實驗材料

大腸桿菌（EscherichiacoliK12）的四個菌株：K12Pro（λ）F+；W1485HisIleF+；W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr（λ）F-；HfrCMetTrp。

Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌體整合在染色體上，His：組氨酸，ilv：異亮氨酸纈氨酸，Thr：蘇氨酸，Leu：亮氨酸，thi：維生素B1，xyl：木糖，Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麥芽糖，lac：乳糖，strr：鏈霉素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。

三、實驗器具和藥品

1.用具：滅菌培養(yǎng)皿（9厘米），滅菌三角瓶（150毫升），滅菌吸管（1、5、10毫升），滅菌離心管，滅菌空試管。