細(xì)胞組分的分析方法――定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)

一.流式細(xì)胞光度術(shù)－單細(xì)胞懸液染色標(biāo)本的多信息分析法

1.概述

　　流式細(xì)胞光度計(jì)(flow cytometry)可定量地測(cè)定某一細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量，以及細(xì)胞群體中上述成分含量不同的細(xì)胞的數(shù)量，特別是它還可將某一特異染色的細(xì)胞從數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞群體中分離出來，以及將DNA含量不同的中期染色體分離出來，因此近年來得到越來越廣泛的應(yīng)用。

　　細(xì)胞群體一般需要分散后對(duì)待測(cè)的某種成分進(jìn)行特異染色，然后將懸液中的細(xì)胞以1個(gè)細(xì)胞／ms的速度(1 000萬細(xì)胞/h)一個(gè)個(gè)地通過流式細(xì)胞儀，此時(shí)檢測(cè)器便可測(cè)出并記錄每個(gè)細(xì)胞中的待測(cè)成分的含量，并根據(jù)要求將該成分含量不同的細(xì)胞分離出來。如果染色過程不影響細(xì)胞活性，那么分離出來的細(xì)胞還可以繼續(xù)培養(yǎng)。

2.工作原理
　　流式細(xì)胞光度計(jì)(簡稱FCM)是將流體噴射技術(shù)、激光技術(shù)、空氣計(jì)數(shù)、γ―射線能譜術(shù)
及電子計(jì)算機(jī)等新技術(shù)與顯微熒光分光光度計(jì)密切結(jié)合的高度精密儀器。在電子計(jì)算機(jī)操作 程序控制下能靈敏而快速地對(duì)大量單細(xì)胞樣品進(jìn)行多信息分析與測(cè)定。目前，F(xiàn)CM技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于生命大分子物質(zhì)的定量、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞表面抗原、受體、染色體、核漿比例、活細(xì)胞分類等細(xì)胞生物學(xué)各領(lǐng)域的研究工作中。

　　其主要工作原理是：經(jīng)熒光染色的單細(xì)胞懸液被高壓壓入流動(dòng)室內(nèi)，在PBS或生理鹽水等殼液(Sheath Fluid)的包裹和推動(dòng)下形成單細(xì)胞狀態(tài)，并以每分鐘5000―10000個(gè)細(xì)胞的高速度從流動(dòng)室內(nèi)噴出。在與細(xì)胞束呈90°角的方向，受到來自氬離子激光器的激光束照射而激發(fā)熒光。通過各種物鏡及濾光片將從不同角度收集的熒光投射到光電倍管并轉(zhuǎn)換為各種強(qiáng)弱不等的電脈沖信號(hào)顯示出來。這些信號(hào)輸?shù)诫娮佑?jì)算機(jī)中貯存，經(jīng)處理和分析便可得到多種信息參數(shù)。進(jìn)行細(xì)胞分類時(shí)，根據(jù)需要對(duì)含細(xì)胞的水滴選擇性充電，在帶有高電壓的偏轉(zhuǎn)板作用下，帶正電荷的水滴落入左方收集管內(nèi)，帶負(fù)電荷的水滴落入右方收集管內(nèi)，不帶電荷的水滴進(jìn)入中間的收集管。分類主要根據(jù)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，即單細(xì)胞DNA含量。

3.FCM系統(tǒng)調(diào)試：
　　以FACS-Ⅲ型機(jī)為例，調(diào)試的原則是：得到較高的分辨率，即對(duì)某一特殊樣品測(cè)得的變 化常數(shù)CV值，CV值越小越好。得到較高的靈敏度，即可測(cè)出最小熒光分子數(shù)。

　　調(diào)試儀器要有理想的標(biāo)準(zhǔn)品，其條件是：①穩(wěn)定；②顆粒大小和熒光性要均勻；⑧標(biāo)準(zhǔn) 品本身的CV值要低于儀器的CV值；④易得，易制成懸液。目前常用的標(biāo)準(zhǔn)品有：④熒光 微球，⑥雞紅血球懸液，它易得，制備方法簡單，易保存，且血紅蛋白可自發(fā)熒光。

4.樣品制備過程
　　著重介紹單細(xì)胞懸液的制備方法，這是生物學(xué)工作者最為關(guān)心的問題。懸液培養(yǎng)樣品或 各種腹水細(xì)胞本身就是單細(xì)胞懸液，可直接使用。下面介紹單層培養(yǎng)樣品及實(shí)體組織的制備方法。

Ⅰ　酶法：應(yīng)用最廣泛的是胰蛋白酶。

(1)單層培養(yǎng)的樣品：器材和試劑：玻璃滴管數(shù)只(滅菌)；5ml移液管5只(滅菌)；10ml移液管3只(滅菌)；離心管數(shù)只(滅菌)；滅菌超凈臺(tái)；恒溫水浴箱；離心機(jī)、冰箱；PBS液(滅菌)；胰蛋白酶溶液。

步驟：①去掉培養(yǎng)基；②用5ml冷PBS滴輕輕沖洗細(xì)胞后去掉；⑧加2毫升胰蛋白酶液，37℃保溫5分鐘，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶或用滴管吹盯數(shù)次使細(xì)胞最大程度游離；④加8ml含血清的培養(yǎng)基以抑制酶活性，⑤把細(xì)胞懸液移到離心管內(nèi)，250g離心5分鐘；⑥棄上清，將細(xì)胞重新懸于10ml冷PBS中，攪勻；⑦250g離心5分鐘，棄上清加5ml乙醇固定，保存于4℃?zhèn)溆谩?/span>

(2)實(shí)體組織：器材和試劑：眼科剪、眼科鑷各一把；50ml小燒杯數(shù)個(gè)；玻璃滴管數(shù)只；小塊雙層紗布；普通光學(xué)顯微鏡；恒溫水浴箱；離心機(jī)；Hank’s平衡鹽水；分離液；中和液。

步驟：①將組織塊剪碎，以Hank’s平衡鹽水洗去紅細(xì)胞；②加分離液，37℃水浴，輕輕攪拌直到液體混濁；⑧在顯微鏡下檢查細(xì)胞分離情況；④靜置數(shù)分鐘后輕輕倒出懸液，以雙層紗布過濾，剩下的細(xì)胞團(tuán)塊可重新加分離液分離；⑤加入與細(xì)胞懸液等體積的中和液；⑥用滴管吹打10次，室溫下靜置5分鐘后再放在冰上，⑦250g離心5分鐘；棄上清，細(xì)胞重新懸于生理鹽水中備用。

　　對(duì)于不同組織，酶用量和pH均可改變。除胰蛋白酶外，還可以用膠原酶、胰肽酶E、透明質(zhì)酸酶或聯(lián)合使用。

Ⅱ　化學(xué)法：

　　因?yàn)槊缚梢韵?xì)胞膜上的某些成份，所以有人用非酶物質(zhì)分離細(xì)胞。用TPB(tetraphenylborom)分離肝、腦、腎和結(jié)締組織，但TPB能抑制細(xì)胞代謝。下面簡單介紹Rappapont和Howze用TPB鈉鹽分離C3H小鼠肝臟細(xì)胞的過程。

器材和試劑：薄刀片；10ml移液管2只；玻璃滴管數(shù)只；帶22號(hào)針頭的注射器1個(gè)；磷酸緩沖液；蔗糖-鹽溶液；TPB分離液。

步驟：①將肝組織切成3―5ml的薄片；②加10mlTPB分離液；③冰浴1―2小時(shí)，并用滴管上下吹打數(shù)次；④將細(xì)胞液通過一22號(hào)針頭，形成單細(xì)胞，⑤250g離心5分鐘，并以生理鹽水洗2次去掉分離液。

　　被分離的肝細(xì)胞數(shù)目隨TPB濃度的增加而增加，其最適濃度范圍是每升10的負(fù)5次方至10的負(fù)2次方摩爾。

Ⅲ　機(jī)械法：

　　通常是將實(shí)體組織切碎，用帶金屬網(wǎng)或尼龍網(wǎng)的注射器制成單細(xì)胞。但此法易引起細(xì)胞破碎和丟失。Crissman(1976)的方法是：①將實(shí)體瘤切碎；②碎組織通過一500nm孔徑的Teflon網(wǎng)；⑧細(xì)胞被收集于生理鹽水液中；④此細(xì)胞懸液被通過一個(gè)100或60nm孔徑的尼龍GM篩；⑤離心使細(xì)胞沉淀；⑥細(xì)胞沉淀直接懸液于染色液中。

　上述三種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，最好是聯(lián)合使用。