馬鈴薯蛋白酶抑制劑可作為抗癌潛力的功能性食品材料
1、Introduction
眾所周知，癌癥的發(fā)生與人體的過度氧化反應(yīng)密切相關(guān)。許多具有抗氧化活性的生物活性物質(zhì)也具有一定的抗癌能力。特別是植物源活性物質(zhì)因其較小的副作用而受到高度重視，用以預(yù)防各種疾病。
蛋白酶抑制劑（PIs）廣泛存在于塊莖和植物種子中，可以抑制病原體的生長，促進(jìn)傷口愈合。此外，PIs還可以作為貯藏蛋白質(zhì)，是種萌發(fā)重要來源。長期以來，由于多數(shù)研究均是以短時間內(nèi)食用含有大量PIs飼料的小動物為研究對象，從而使PPIs在營養(yǎng)學(xué)角度上被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，而這種飲食模式在與人們?nèi)粘ｏ嬍硯缀跏遣幌喾摹Ｒ虼耍瑧?yīng)該正確看待PIs對人類健康的影響。
馬鈴薯蛋白酶抑制劑（PPI）是馬鈴薯分離蛋白的主要成分，占總蛋白的50%，根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和羧肽酶抑制劑。PPIs中必須氨基酸含量高，如絲氨酸、亮氨酸和谷氨酸，具有功能性的氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸含量也較高。研究報道PPIs可以調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白水解活性，抑制腫瘤生長，保護(hù)肝臟，維持健康的免疫系統(tǒng)等，對維持正常的生命活動具有重要意義。為了在功能性食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，有必要證明無毒前提下PPIs在細(xì)胞水平上可以具有令人滿意的抗氧化和抗腫瘤活性。
近期，沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院研究團(tuán)隊在前序研究的基礎(chǔ)上以PPIs為研究對象，分析其在細(xì)胞水平上是否具有抗氧化和抗腫瘤活性。結(jié)果表明PPs可以顯著降低H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞癌（HepG2）細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的氧化損傷，抑制細(xì)胞形態(tài)變化，保持細(xì)胞完整性。此外，PPIs對GIST882細(xì)胞生長、遷移和侵襲均具有很好的效抑制作用。這些發(fā)現(xiàn)可以為PPIs作為功能性食品材料提供科學(xué)依據(jù)。
2、Results and Discussion
2.1 PPIs抗氧化能力評價
在本研究中，作者首先利用PSC和CAA方法評估PPI的抗氧化活性。通過PSC評估PPIs的體外總抗氧化活性，隨著PPIs濃度的增加，PPIs的PSC值從（233±86）mg VCE/100 g提高到（2119±204）mg VCE/100 g。在此基礎(chǔ)上，通過CAA評估PPs對細(xì)胞整體以及在細(xì)胞內(nèi)抗氧化作用。結(jié)果表明，未經(jīng)PBS洗滌的PPIs的CAA值（8.74±2.1～45.83±3.5μmol QE/100 g）高于經(jīng)PBS洗滌PPIs的CAA值（3.3±5.3~33.25±4.4 μmol QE/100 g）。這是因為未經(jīng)PBS洗滌的CAA值代表PPI在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性，經(jīng)PBS洗滌的CAA值僅代表PPIs在細(xì)胞中抗氧化劑的活性。
2.2 對細(xì)胞樣化損傷的保護(hù)作用
正常生長的HepG2細(xì)胞呈梭形，HUVEC細(xì)胞呈多邊形。兩種細(xì)胞均大小均勻，邊緣清晰光滑。經(jīng)H2O2處理后，可以觀察到HepG2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞收縮，形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)細(xì)胞碎片。經(jīng)PPIs預(yù)處理后損傷細(xì)胞數(shù)量明顯減少，黏附程度增加，細(xì)胞形態(tài)更加豐滿，細(xì)胞邊緣更加清晰光滑。
為了評估 PPIs對HepG2和HUVEC細(xì)胞氧化損傷的影響，分別研究了細(xì)胞的LDH釋放率、MDA、SOD 和NO水平的變化。H2O2處理后的HepG2 和 HUVEC 細(xì)胞的MDA水平和 LDH釋放率著增加。PPIs預(yù)處理后HepG2 和 HUVEC 細(xì)胞的MDA水平和LDH釋放率明顯降低。此外，H2O2 處理后的HepG2 和 HUVEC 細(xì)胞中SOD活性和NO水平顯著降低，PPI預(yù)處理后可以顯著阻止下降趨勢。
2.3 PPIs的抗腫瘤活性
以四種腫瘤細(xì)胞（A549、MKN45、K568和GIST882）為研究對象，探索PPIs的抗腫瘤活性。PPI對GIST882細(xì)胞株的抑制活性最高，IC50值為（10.53±3.87）mg/mL，對MKN45和K568細(xì)胞株有顯著抑制作用，IC50值為（186.60±5.37）和（178.21± 3.13) mg/mL，但對 A549 細(xì)胞系未發(fā)現(xiàn)明顯影響。
隨著PPIs濃度的增加，處于S期的GIST882細(xì)胞在百分比從33.88%增加到51.87%；處于G2/M期的GIST882細(xì)胞百分比從 12.46%增加到25.12%；處于G0/G1期的GIST882細(xì)胞百分比從53.66%下降到26.9%。PPIs可以在S期和G2/M期阻滯細(xì)胞周期，影響GIST882細(xì)胞的正常分裂，抑制其生長。
正常生長細(xì)胞呈綠色，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞膜完整；晚期凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)橘色。經(jīng)PPIs處理后的GIST細(xì)胞鐵壁能力變差，形態(tài)發(fā)生變化，伴有明顯的膜起泡和核收縮。同時，隨著PPIs濃度的增加，GIST882細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡形態(tài)變得更加清晰。細(xì)胞凋亡的膜聯(lián)蛋白 V-Alexa Fluor 488/PI 染色分析結(jié)果表明，隨著 PPIs 濃度的增加，Q2 和 Q4 的百分比逐漸增加。隨者PPIs濃度的增加，處于Q2和Q4的GIST882細(xì)胞總凋亡百分比分別為18.6%、30.9% 和 57.6%。
GIST882細(xì)胞48 h傷口愈合試驗的結(jié)果，PPIs降低了GIST882細(xì)胞的遷移率，說明PPIs可以有效抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，防止癌癥惡化。
3、Conclusion
在本研究中，作者發(fā)現(xiàn) PPIs具有良好抗氧化和抗癌活性。PPIs對由H2O2誘導(dǎo)HepG2和HUVEC細(xì)胞的損傷具有保護(hù)作用，且無毒性。此外，PPIs還可以抑制GIST882腫瘤細(xì)胞的生長，將其阻斷在S期和G2/M期并抑制其遷移能力。
