植物微核檢測實驗

一、實驗目的
1．了解微核測試的原理和毒理遺傳學在實際生活與工作中的應用范圍及意義
2．學習蠶豆根尖的微核測試技術

二、實驗原理
微核簡稱(MCN)，是真核生物細胞中的一種異常結構，往往是細胞經輻射或化學藥物的作用而產生。在細胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外、大小應在主核1／3以下。微核的折光率及細胞化學反應性質和主核一樣。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產生的，但有些實驗也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細胞分裂末期被兩個子細胞核 所排斥便形成了第三個核塊。已經證實微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應呈正相關，這一點和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡易的間期微核計數來代替繁雜的中期畸變染色體計數。由于大量新的化合物的合成，原子能應用，各種各樣工業廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術簡單的測試系統來監視環境的變化。只有真核的測試系統更能直接推測誘變物質對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進行微核測試與以動物進行的一致率可達99%以上。目前微核測試已經廣泛應用于輻射損傷、輻射防護、化學誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。
利用蠶豆根尖作為實驗材料進行微核測試，可準確的顯示各種處理誘發畸變的效果，并可用于污染程度的監測。

三、實驗材料
松滋青皮豆（蠶豆）種子

四、實驗器具和藥品
實驗器具：顯微鏡、載玻片、蓋玻片、培養皿、濾紙
實驗藥品：氯化鈷

五、實驗過程
1．實驗材料的培育
蠶豆根尖細胞的染色體 大，DNA含量高．因而對誘變因子反應敏感。松滋青皮豆是從不同蠶豆品種中篩選出來的一種較為敏感的品種。本品種引入后在栽培繁殖時要注意不要同其它蠶豆品種種在一起，不噴灑農藥、以保持該品種較低的本底微核值。也可用其它蠶豆品種，但是必須設置對照組。種子成熟后，曬干貯藏于干燥器內或4℃冰箱內備用。
2．浸種催芽：將實驗用蠶豆種子按需要量放入盛有蒸餾水的燒杯中，在25℃下浸泡24小時，此間至少換水兩次．所換水應25℃預溫。種子吸脹后；用紗布松散包裹置白磁盤中，保持濕度，在25℃溫箱中催芽12－24小時，待初生根長出2—3mm時，再取發芽良好的種子，放入鋪滿濾紙的磁盤中，25℃繼續催芽，經約36～48小時．大部分初生根長至1～2cm左右，根毛發育良好，這時即可用來進行檢測了。
3． 處理
用被檢測液處理根尖，每一處理選取6－8粒初生根尖生長良好、根長一致的種子，放入盛有被檢測液的培養皿中，被檢測液浸泡根尖。同時，取另一培養皿以蒸餾水處理根尖，作為對照。
處理時間約為6小時（此時間可根據實驗要求和被檢測液的濃度等情況而定）。
4．根尖細胞恢復培養
將處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2－3min。將洗凈的種子再放入鋪好濾紙或脫脂棉的白磁盤內25℃溫箱中恢復培養22－24小時。
5．固定根尖細胞
將恢復后的種子從根尖頂端切下1cm長的幼根放入廣口瓶中，以卡納氏固定液進行固定2-24小時后，保存于70%乙醇溶液中。
6．鏡檢及微核識別標準
常規制片后，將玻片標本放在顯微鏡的低倍鏡下觀察，找到分生組織區細胞分散良好、核膨大、分裂相多的部分轉到高倍鏡下進行觀察。
微核識別標準：
（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。
（2）小核著色與主核相當或稍淺。
（3）小核形態為圓形、橢圓形或不規則型。
每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數1000個細胞中的微核數并進行記錄。
蠶豆根尖微核檢測記錄表

六、實驗數據的統計處理和污染程度劃分
將實驗數據按一下步驟進行統計學分析處理：
1． 計算各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MCN‰）
如果對照本底MCN‰為10 ‰以下，可采用如下標準進行分析以確定樣品的污染程度：MCN‰在10‰以下，表示基本沒有污染；MCN‰在10‰－18‰區間，則表示有輕度污染；MCN‰在18‰－30‰區間，則表示有中度污染；MCN‰在30‰以上，則表示有重度污染；也可以采用“污染指數”判別：此方法可避免因實驗條件等因素帶來的MCN‰本底的波動，方法如下：污染指數在0－1.5區間為基本沒有污染；污染指數在1.5－2區間為輕度污染；污染指數在2－3.5區間為中度污染；污染指數在3.5以上為重度污染；如果對照本底MCN‰為10 ‰以上，可采用t檢驗（被測樣品較少時）檢測處理液致畸效果是否明顯，或以F檢驗（被測樣品較多時）檢測各處理之間是否具有顯著的差異。

七、注意事項：
1.凡數值在上下限時，定為上一級污染。
2.對嚴重污染的水環境進行檢測時，檢測處理會造成根尖死亡，應稀釋后再作測試；
3.在沒有空調恒溫設備時，如室溫超過30℃，MCN本底可能有升高現象，但可經污染指數法數據處理，不會影響檢測結果。