最全面的MTT相關(guān)技巧大匯總

（一）實(shí)驗(yàn)前應(yīng)明確的問題

1. 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞 接種濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細(xì)胞 長滿時(shí)約有105個(gè)細(xì)胞 。但由于不同細(xì)胞 貼壁后面積差異很大，因此，在進(jìn)行MTT試驗(yàn)前，要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測其貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞 數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗(yàn)中每孔的接種細(xì)胞 數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止致細(xì)胞 過滿。

這樣，才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細(xì)胞 數(shù)呈的線性關(guān)系。否則細(xì)胞 數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

2. 藥物濃度的設(shè)定。一定要多看文獻(xiàn)，參考別人的結(jié)果再定個(gè)比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時(shí)間范圍再細(xì)篩。切記！否則，可能你用的時(shí)間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時(shí)間。

3. 時(shí)間點(diǎn)的設(shè)定。在不同時(shí)間點(diǎn)的測定OD值，輸入excel表，最后得到不同時(shí)間點(diǎn)的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時(shí)候變得平坦了（到了平臺(tái)期）那個(gè)時(shí)間點(diǎn)應(yīng)該就是最好的時(shí)間點(diǎn)（因?yàn)檫@個(gè)時(shí)候的細(xì)胞 增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）。

4. 培養(yǎng)時(shí)間。200 ul的培養(yǎng)液對(duì)于10的4～5次方的增殖期細(xì)胞 來說，很難維持68 h，如果營養(yǎng)不夠的話，細(xì)胞 會(huì)由增殖期漸漸趨向 g0期而趨于靜止，影響結(jié)果，我們是在48 h換液的。

5. MTT法只能測定細(xì)胞 相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測定細(xì)胞 絕對(duì)數(shù)。做MTT時(shí)，盡量無菌操作，因?yàn)榧?xì)菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高。

6. 理論未必都是對(duì)的。要根據(jù)自己的實(shí)際情況調(diào)整。

7. 實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔，對(duì)照孔，加藥孔。調(diào)零孔加培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜。對(duì)照孔和加藥孔都要加細(xì)胞 、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜，不同的是對(duì)照孔加溶解藥物的介質(zhì)，而加藥組加入不同濃度的藥物。

8. 避免血清干擾。用含15％胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞 時(shí)，高的血清物質(zhì)會(huì)影響試驗(yàn)孔的光吸收值。由于試驗(yàn)本底增加，會(huì)試驗(yàn)敏感性。因此，一般選小于10％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。

（二）實(shí)驗(yàn)步驟

貼壁細(xì)胞 ：

1. 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞 ，調(diào)整細(xì)胞 懸液濃度，每孔加入100 ul,鋪板使待測細(xì)胞 調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。

2. 5%CO2，37 ℃孵育，至細(xì)胞 單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞 貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥. 一般5-7個(gè)梯度,每孔100 ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔. 建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3. 5%CO2，37 ℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4. 每孔加入20 ul MTT溶液（5 mg/ ml，即0. 5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5. 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6. 每孔加入150 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值。

7. 同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞 、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）

懸浮細(xì)胞 ：

1）收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞 ，調(diào)節(jié)細(xì)胞 懸液濃度1×106/ ml，按次序?qū)?br style="box-sizing: border-box;"/>①補(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40 ul ；
②加Actinomycin D（有毒性）10 ul用培養(yǎng)液稀釋 l g/ ml，需預(yù)試尋找最佳稀釋度，1:10-1:20)；
③需檢測物10 ul；
④細(xì)胞 懸液50 ul（即5×104cell/孔），共100 ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100(儲(chǔ)存液100 1640）。

2）置37 ℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ ml，即0. 5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞 推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值）

4）離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570 nm（630 nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。

5）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞 、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。

（三）MTT的配制

MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4 ℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5 mg/ ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多,尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。

MTT有致癌性，用的時(shí)候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套. 配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.

配制MTT時(shí)用用PBS溶解,也有人用生理鹽水配，60 ℃水浴助溶。

PBS配方:Nacl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，調(diào)ph 7.4，定容1 L。

（四）關(guān)于細(xì)胞 的接種(鋪板)

細(xì)胞 過了30代以后就不要用了,因?yàn)闋顟B(tài)不好了;培養(yǎng)板要用好的（最好進(jìn)口板），不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

接種時(shí)最好按照預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出的密度接種, 因?yàn)榧?xì)胞 密度在10000/ ml左右時(shí)，所測得的OD值的區(qū)間即細(xì)胞 抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線性關(guān)系最好，結(jié)果最可信。如果鋪的太稀細(xì)胞 的殺傷不會(huì)很明顯，太密細(xì)胞 可能都會(huì)凋亡，因?yàn)榧?xì)胞 長的太快營養(yǎng)會(huì)不夠，最后導(dǎo)致死亡。

且而細(xì)胞 過密或者過少，增殖都會(huì)過快或者過慢，其增值率線性關(guān)系不佳。故而MTT細(xì)胞 密度多采用10000/ ml，100 ul/孔。

細(xì)胞 密度要根據(jù)不同細(xì)胞 的特點(diǎn)來定. 如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞 具有刺激作用那么取小點(diǎn)的細(xì)胞 濃度，如果你做的藥品對(duì)細(xì)胞 具有抑制作用那么取大點(diǎn)的細(xì)胞 濃度，這樣與對(duì)照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好。懸浮細(xì)胞 每孔的細(xì)胞 數(shù)可達(dá)到105,貼壁細(xì)胞 可為103-104.

其它的聲音：

1. 首先細(xì)胞 的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個(gè)左右就夠了，我認(rèn)為寧少勿多。尤其是對(duì)于腫瘤細(xì)胞 。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用，MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點(diǎn)板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會(huì)很大。

2. MTT本身就是比較粗的實(shí)驗(yàn)，增殖率10%左右的波動(dòng)都不算奇怪。特別是新手，20％的波動(dòng)也是常見的，所以很可能是技術(shù)原因引起的，特別是種板技術(shù)一定要過關(guān)。

3. 我做的是腫瘤細(xì)胞 的MTT實(shí)驗(yàn),這種細(xì)胞 長的很快一開始我是用100000/ ml的濃度來接種的,結(jié)果細(xì)胞 長的太滿結(jié)果是沒有梯度也沒有線性關(guān)系. 后來調(diào)整濃度,用過40000~80000/ ml的濃度都做過MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)做的結(jié)果比較好點(diǎn)的是60000~70000/ ml的濃度組的.

用40000/M的濃度的組,由于細(xì)胞 少,藥物作用的梯度還是有,只是沒有很好的線性關(guān)系. 還有根據(jù)細(xì)胞 生長速度以及藥物的特性(有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養(yǎng)時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).

注意細(xì)胞 懸液一定要混勻，已避免細(xì)胞 沉淀下來，導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞 數(shù)量不等，可以每接幾個(gè)就要再混勻一下。加樣器操作要熟練，盡量避免人為誤差。雖然移液器比移液管精確得多，但是如果操作不熟，CV會(huì)在8%左右。另外，吹散次數(shù)過多也會(huì)影響細(xì)胞 活力。所以要熟練鞋、快些上板。

首先說說我的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)：

1. 吹打時(shí)懸液總量不能太多，達(dá)到吸管吸液量的3到4倍，可能比較容易混勻。10 ml的離心管里面最好裝3~4 ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細(xì)胞 懸液。。。

2. 吸管的吸液量最好在1 ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會(huì)不均勻。如果是吸液量1 ml多的吸管，總液量在5 ml左右為益

3. 吸的時(shí)候要在懸液底部，然后提起來一點(diǎn)，但是吹下去的時(shí)候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。

4. 吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認(rèn)為加細(xì)胞 前吹打30－50次基本就差不多均勻了。加細(xì)胞 的時(shí)候每接種2孔反復(fù)吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細(xì)胞 懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液。）

5. 向每孔中用槍頭加入細(xì)胞 時(shí)不要太快，否則你會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞 在加入的瞬間會(huì)由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周邊很少，這種不均勻的分散會(huì)產(chǎn)生接觸抑制，影響細(xì)胞 的生長。所以速度不能太快也不能太慢。

我習(xí)慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回復(fù)3下移動(dòng)，目的是使得細(xì)胞 能分散的均勻些。（鋪板技術(shù)是MTT實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，也是基礎(chǔ)，一定要練好。曾經(jīng)有同學(xué)用漩渦振蕩器混勻細(xì)胞 ，最后細(xì)胞 全死了，建議不要采用這種方法混勻細(xì)胞 。

（五）加入MTT

個(gè)人認(rèn)為MTT最關(guān)鍵的是你的細(xì)胞 數(shù)目和你加入真正起作用的的MTT的適當(dāng)比例，具體細(xì)胞 數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關(guān)系確實(shí)不好確定，我認(rèn)為MTT多加一些比少加好一些

MTT的量各家報(bào)道不同，一般是過量的，所以10 ul即夠了。如果不使用96孔板，培養(yǎng)基超過100 ul，MTT按照10%的比例加入. 加入MTT以后振蕩一下讓MTT與培養(yǎng)基混勻，不過這個(gè)應(yīng)該關(guān)系不大。

如加入MTT后都有個(gè)別孔立即變?yōu)樗{(lán)黑色，則污染的可能性大,另外MTT稀後加入胞前是需要以的方式菌宜. 且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的

因?yàn)檠逯邪椎鞍讓?duì)大部分的藥物都有結(jié)合效應(yīng)，所以可以單獨(dú)將藥物和MTT加在一起，看會(huì)不會(huì)起反應(yīng)。如果不起反應(yīng)，就不用去除含藥物的培液，直接加MTT即可。