脂質(zhì)體介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有三種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法，實(shí)際上其基本原理都是利用不同的方法在細(xì)胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入，但是由于前兩者的效率低且傷害較大，所以現(xiàn)在除了對于一些特殊細(xì)胞系，一般的轉(zhuǎn)染 方法都利用脂質(zhì)體。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 和其他方法一樣，最重要的就是防治其毒性，因此脂質(zhì)體與治理的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。

本實(shí)驗學(xué)習(xí)和掌握外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的主要方法 — 脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達(dá)(綠色熒光蛋白)。

【試劑與儀器】

1 、胎牛血清。

2 、雙抗溶液(鏈霉素 100μg+ 青霉素 100 單位)。

3 、DMEM 培養(yǎng)基。

4 、轉(zhuǎn)染 試劑( LIPOFECTAMINE 2000 )。

5 、細(xì)胞培養(yǎng)基( DMEM+10%NCS )。

6 、PBS 。

7、無血清培養(yǎng)基。

8 .胰酶( Trypsin )。

9 .培養(yǎng)皿，移液管，量筒，恒溫水浴箱，離心機(jī)， 15ml 離心管，微量移液器，熒光顯微鏡和 CCD 。

【操作步驟】

(1)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化

為了得到最高的轉(zhuǎn)染效率和最低的非特異性的效果，優(yōu)化條件是必要的，其中包括細(xì)胞的密度以及DNA和脂質(zhì)體的含量。要確保細(xì)胞的匯合率大于90%，調(diào)整DNA和脂質(zhì)體的比值從1:0.5 到1:5來進(jìn)行優(yōu)化。

(2)正式轉(zhuǎn)染步驟

1 、轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)，細(xì)胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為 90% 。細(xì)胞鋪板在 0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。

2、對于每孔細(xì)胞，使用 50μl 無血清 DMEM 培養(yǎng)基稀釋 0.8μg-1.0μg DNA 。多孔操作可以批量制備。

3、對于每孔細(xì)胞，使用 50μl DMEM 培養(yǎng)基稀釋 1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000 試劑。 LIPOFECTAMINE 2000 稀釋后，在 5 分鐘內(nèi)同稀釋的 DNA 混合。保溫時間過長會降低活性。

4、混合稀釋的 DNA (由第 2 步)和稀釋的 LIPOFECTAMINE 2000 (由第 3 步)。在室溫保溫 20 分鐘。復(fù)合物可以在室溫保持 6 小時穩(wěn)定。注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉(zhuǎn)染。

5、直接將復(fù)合物加入到每孔中，邊加邊搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為 0.5ml 無血清培養(yǎng)基。

6、在 37℃ ， 5 %的 CO 2 中孵育 24-48 小時，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在 4-5 小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。

7、在細(xì)胞中加入復(fù)合物 24-72 小時后，分析細(xì)胞抽提物或進(jìn)行原位細(xì)胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細(xì)胞類型和啟動子活性。

對穩(wěn)定表達(dá)，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細(xì)胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)需要數(shù)天或數(shù)周。