體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變試驗－ 中華倉鼠肺細胞染色體突變實驗

中華人民共和國國家標準
GB 15193．12一91
體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變試驗
V79/HGPRT gene mutation test
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1  主體內容與適用范圍
1.1  本標準規定了體外哺乳類細胞（V79/HGPRT）基因突變試驗的基本技術要求。
1.2  本標準適用于需要進行食品安全性評價的用作或用于食品的化學物質。
2  原理
2.1  細胞在正常培養條件下，對6－TG的毒性作用敏感，不能生存，在致癌物和致突變物作用下，某些細胞X染色體上控制次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）的結構基因發生突變，不能再產生HG-PRT，從而使突變細胞對6-TG具有抗性作用。這些突變細胞在含有6-TG的選擇性培養液中能繼續分裂并形成集落。根據突變集落形成數，計算突變率以判定受試物的致突變性。
3  材料和試劑
3.1  細胞：使用中國倉鼠肺（v79）細胞株。為了減少自發突變率，正式實驗前先將野生型細胞群體中存在的自發HGPRT座位突變體選擇性殺滅，方法是將野生型細胞接種于含次黃嘌呤及胸腺嘧啶，氨甲氨甲喋呤，甘氨酸的MEM培養液中培養1周，然后重新接種于MEM培養液中。
3.2  培養液：采用MEM（Eagle）基礎培養液或DMEM培養液，補以10％小牛血清及適量抗菌素（青霉素，鏈霉素）。
3.3  磷酸緩沖液（無鈣、鎂PBS）
磷酸二氫鉀
（KH2PO4）  0.2 g
磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）  2.89 g
氯化鉀
（Kcl）  0.2 g
氯化鈉
（NaCl）  8.0 g
雙蒸水  1000 mL
高壓消毒，121℃，0.103 MPa，20 min。
3.4  胰蛋白酶／EDTA溶液：用無鈣、鎂PBS配制，胰酶的濃度為0.05％，EDTA的濃度為0.02％，胰蛋白酶與EDTA溶液按1:1混合。-20℃貯存。
3.5  受試物：最好能溶于培養液。也可溶于二甲基亞砜（DMSO），其濃度應低于0．5％（v／v）。
3.6  陽性對照物：可根據受試物的性質和結構選用不同的陽性對照物，例如甲基磺酸乙酯（EMS），絲裂酶素C（MMC），甲基硝基亞硝基肌（MNNG），苯并 芘(BP)等。
3.7  6－TG用0.5％碳酸氫鈉溶液配成1.0 mg/ml，4℃貯存。
3.8  大鼠肝勻漿S-9混合物，按Ames試驗程序制備。
4  實驗步驟
4.1  細胞準備：將5X105個細胞接種于直徑為100 mm平皿中，于37℃，5％二氧化碳培養箱中放置 24h．
4.2  接觸受試物：吸去培養液，PBS洗兩次，加入無血清培養液及一定濃度的受試物（需代謝活化者同時加人大鼠肝勻漿S-9混合物），置于培養箱中2h，結束后吸去含受試物的培養液，用PBS洗細胞兩次，換入含10％血清的培養液，繼續培養19～22 h。
4.3  表達：接觸受試物的細胞繼續培養19～22h后用胰酶。EDTA消化，待細胞脫落后，加入含10％血清培養液終止消化，混勻，放入離心管以800～1000 r/min的速度離心5～7min，棄去上清液，制成細胞懸液，計數，以5×105個細胞接種于直徑為100mm的平皿，3d后分傳一次，仍接種5x105個細胞培養3d。
4.4  細胞毒性測定：將上述首次消化計數后的細胞每皿接種200個，每組5個皿，37℃，5％二氧化碳條件下培養7d，固定，Giemsa，染色，計數每皿集落數，以相對于溶劑對照組的集落形成率表示細胞毒性、即以溶劑對照的集落形成率力100％（1.00），求出各檢品試驗組的相對值。
B
A（％）=---×1000 ………………………(1)
C
    式中：A――相對集落形成率；
   B――試驗組集落形成率；
C――溶劑對照組集落形成率。
4.5  突變體的選擇及集落形成率的測定：表達結束后，消化細胞 分種，每組5個皿，每皿種2x105 個細胞，待細胞貼壁后加入6-TG，終濃度為5μg/mg，放入培養箱培養8-10 d后固定，Giemsa染色，統計每皿集落數，并計算突變率。同時另做集落形成率測定，每皿接種200個細胞，不加6-TG，每組5個皿。 7d后固定染色，計算集落形成率。
E
D=--- ……………………………（2）
F
    式中: D――集落形成率；
B――實際存活的細胞集落數；
F――接種細胞數。
4.6  計算
H 1
G=---×--- ……………………………（3）
I D
式中：G――突變率；
     H――突變集落數；
     I――接種細胞數；
     D――集落形成率。
5  結果判定
5.1  若陰性對照中，集落形成率低于50％，結果應不予采用。
5.2  各實驗室選用的陽性對照突變率有一定范圍，若受試物的結果為陰性或弱陽性時，陽性對照的誘變率應達正常值的下線以上，否則結果不能成立。
5.3  當突變率為自發突變率的3倍或3倍以上，或至少在3個濃度范圍內突變率有隨濃度遞增而升高的劑量反應關系時，可判為陽性。
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附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。
本標準主要起草人馮繼農、高礬。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。