流式細(xì)胞術(shù)在高等植物研究中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，簡(jiǎn)稱FCM)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對(duì)細(xì)胞的物理性質(zhì)及化學(xué)性質(zhì)，如細(xì)胞大小、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等進(jìn)行快速測(cè)定并可分類收集的技術(shù)。該技術(shù)超越了傳統(tǒng)顯微分析技術(shù)，能在瞬間對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。這種快速有效的細(xì)胞分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)等生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域【--，在其基礎(chǔ)上建立的流式細(xì)胞儀系統(tǒng)，具有體積小、功能全和使用方便等特點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要介紹FCM 的原理，對(duì)其在高等植物研究中的應(yīng)用作了綜述。

1流式細(xì)胞術(shù)的原理
流式細(xì)胞術(shù)是一種能夠?qū)σ毫髦械募?xì)胞或其他微粒進(jìn)行多參數(shù)快速分析和分選的技術(shù)。它的工
作原理是：在一定壓力下，細(xì)胞隨鞘液從樣品池通過噴嘴中心進(jìn)入照明室，通過激光束時(shí)使激光發(fā)生
散射和折射，由前向散射光(FSC，F(xiàn)orward scatter)和側(cè)向散射光(ssc，Side scatter)檢測(cè)器把散射光信
號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，同時(shí)細(xì)胞所攜帶的熒光素被激發(fā)后所發(fā)出的熒光由聚光器收集。不同顏色的熒光被
雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的光電倍增管檢測(cè)器，經(jīng)放大后的熒光信號(hào)和散射光信號(hào)一起通過數(shù)據(jù)化處理，
再輸入電腦儲(chǔ)存并據(jù)此對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析和分選t21。
流式細(xì)胞術(shù)的主要特點(diǎn)是：
① 測(cè)量速度快，可在1 S內(nèi)測(cè)定數(shù)萬個(gè)細(xì)胞；
② 同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理特性、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
③ 是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等領(lǐng)域的知識(shí)和成果；
④ 既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。
總之，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。

2.細(xì)胞的參量和熒光探針
FCM 是通過測(cè)量細(xì)胞的多種參量來獲取信息的，細(xì)胞參數(shù)分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量?jī)纱箢悺＝Y(jié)
構(gòu)參量主要用于描述細(xì)胞的化學(xué)組分和形態(tài)特征，例如DNA、RNA的含量，總蛋白含量、胞內(nèi)PH值
和細(xì)胞大小等；功能參量主要是描述細(xì)胞整體的理化和生物特性，如：細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)、特殊配體的鑒
定、特殊細(xì)胞的生物活性等，這些參量有的需要經(jīng)熒光標(biāo)記才能被測(cè)定，有的并不需要熒光標(biāo)記[4]。
2．1參數(shù)測(cè)量的原理
流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量時(shí)，信息主要來自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。測(cè)量是在測(cè)量
區(qū)進(jìn)行，所謂測(cè)量區(qū)就是照射激光束與噴出噴孔的液流束的垂直相交點(diǎn)。當(dāng)液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過
測(cè)量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2"tr的整個(gè)空間散射光線， 散射光的波長(zhǎng)和入射光的波長(zhǎng)相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號(hào)對(duì)未經(jīng)染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過固定和染色處理的細(xì)胞由于其光學(xué)性質(zhì)的改變，散射光信號(hào)不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞參數(shù)相關(guān)，還跟散射角及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。
2．2細(xì)胞參數(shù)的測(cè)定
2．2．1 DNA和RNA含量
對(duì)DNA和RNA的測(cè)定及其含量的分析可以用多種熒光探針標(biāo)記后測(cè)出。常用的熒光探針有吖啶橙(AO，Acridine―orange)、派洛寧Y(PY，I~yronineY)、HO(Hoechst)系列和色霉素A (CA )等。利用HO／CA 雙染色還可分析DNA的堿基組成，另外還可以結(jié)合BrdU(Bromodeoxyuridine，溴脫氧尿嘧啶核苷)單克隆抗體免疫熒光來測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA的合成。
2．2．2蛋白質(zhì)總量
用FCM 可以測(cè)定細(xì)胞中蛋白的總含量，以檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞群體生長(zhǎng)和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細(xì)胞亞群。檢測(cè)總蛋白的常用熒光探針為異硫氰酸熒光素(FITC，Huorescein isothio―cyanate)，F(xiàn)ITC以共價(jià)鍵與蛋白上帶正電的殘基結(jié)合，經(jīng)藍(lán)光激發(fā)后發(fā)出明亮的綠色熒光。
2．2．3特殊配體
配體是與不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合很強(qiáng)的各種大分子和小分子物質(zhì)，通過對(duì)特異性熒光標(biāo)記配體的測(cè)定可以獲得不少有關(guān)結(jié)構(gòu)參量和功能參量的信息。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、羅丹明系列(如四甲基異硫氰酸羅丹明TRITC、異硫氰酸羅丹明X-RITC和美國(guó)德州紅等)、藻膽蛋白系列等。
2．2．4生物活性
生物活性的測(cè)定主要包括兩方面：① 細(xì)胞本身的死活；② 活細(xì)胞生物功能發(fā)揮的強(qiáng)弱。FCM用來判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有兩大類：一類是能透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)，例如二乙酸熒光素(FDA，F(xiàn)luorescein diacetate)，它可被活細(xì)胞滯留而發(fā)出黃綠色熒光。若細(xì)胞有損傷則會(huì)從細(xì)胞中流失，觀察不到熒光。另一類不能透過活細(xì)胞膜，但能對(duì)固定的細(xì)胞及膜破損的細(xì)胞核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶(PI，Propidium iodide)和溴化乙錠(EB，Ethidium bromide)。
3流式細(xì)胞術(shù)在高等植物中的應(yīng)用
3．1應(yīng)用于植物中的特殊性
由于植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上的差異，例如植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁、特殊細(xì)胞器以及中央液泡等，因此流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于植物細(xì)胞時(shí)，在樣品制備、染色、儀器的改造等方面都應(yīng)適應(yīng)植物細(xì)胞的上述特點(diǎn)。
3．1．1制備植物染色體懸液的材料
1984年De Laat和Blass用纖細(xì)單冠菊(Happus gracilis)的懸液細(xì)胞第一次對(duì)植物染色體懸液進(jìn)行流式計(jì)數(shù)分析，然而核型的不穩(wěn)定性卻成為流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用于計(jì)數(shù)的最大障礙。隨后ConiatS]等嘗試著從幼葉原生質(zhì)中分離出染色體進(jìn)行分析，但由于細(xì)胞同步化程度較低，這種方法沒有得到廣泛的應(yīng)用。直到1992年Dolezelt9]~lJ用根尖分裂組織制備細(xì)胞懸液，由于大多數(shù)植物的根尖較易獲得且其核型較穩(wěn)定，因此利用根尖材料制備染色體懸液成為廣泛使用的方法。
3．1．2細(xì)胞周期同步化和中期染色體富集
為了富集足量同步化的中期染色體，秋水仙堿常被用于抑制有絲分裂過程中紡綞絲的形成。但由于其對(duì)植物微管蛋白親和力較低，需要使用較高的濃度，對(duì)人體會(huì)造成高毒性的危害以及在植物遺傳上產(chǎn)生不穩(wěn)定性。另外秋水仙堿也會(huì)導(dǎo)致染色體過于粘稠，不適用于染色體分揀等后續(xù)操作。1992年Dolezel等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用甲基氨草磷(APM’Apiprophos―methy1)、安磺靈(Oryzalin)、氟樂靈(Trifluralin)等人工除草劑代替秋水仙堿，在微摩級(jí)濃度時(shí)便可見顯著的抗微管作用。
3．1．3染色體懸液的制備
由于植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁，對(duì)染色體的分離造成了一定困難，通常有兩種方法從同步化的細(xì)胞中釋放染色體。其一，利用果膠酶和纖維素酶酶解細(xì)胞壁，然后將所獲得的原生質(zhì)體置于低滲緩沖液中，使得染色體得以釋放；其二，將同步化根尖細(xì)胞經(jīng)甲醛固定后進(jìn)行機(jī)械分離從而釋放染色體。相對(duì)而言，后者更加快速，并且避免了長(zhǎng)時(shí)間的酶解，減輕了對(duì)染色體的傷害。
3．1．4儀器的改造
由于植物細(xì)胞原生質(zhì)體較大且脆弱，所以應(yīng)使用100―200 Ixm孔徑的噴嘴，還應(yīng)降低鞘液的壓力以保證通過噴孔的層流條件，并能夠觀察到液滴的形成，同時(shí)降低液滴形成的信號(hào)頻率，以使直徑大的液流能準(zhǔn)確的形成液滴。此外還需降低液滴偏轉(zhuǎn)系統(tǒng)，以便觀察液滴。
3．2在植物學(xué)研究中的應(yīng)用
3．2．1細(xì)胞核分析
FCM 在細(xì)胞核分析方面的應(yīng)用范圍涉及DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量的分析、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞周期分析、倍性分析等方面，是FCM在植物中應(yīng)用最廣泛、最基本的領(lǐng)域。Van’t Hof[ 0]用Hoechst33258熒光素對(duì)棉花(Gossypium hirsutum cv．MD5 1ne)纖維細(xì)胞進(jìn)行染色后，以人類口腔上皮細(xì)胞的細(xì)胞核DNA含量作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，通過FCM 分析， 發(fā)現(xiàn)花期過后2 d的胚珠內(nèi)DNA含量增加了24％。由于在細(xì)胞周期的各時(shí)相中，染色質(zhì)的凝集程度不同，經(jīng)酸或堿處理后，變性程度也不同，Rayburn等通過調(diào)整與DNA結(jié)合方式不同的兩種染料的比例，經(jīng)FCM 分析后確定玉米(Zea mays)中異染色質(zhì)的含量。通過流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期變化情況進(jìn)行分析，李濤等【 2]認(rèn)為交變應(yīng)力作用可直接影響煙草細(xì)胞或細(xì)胞分裂的同步化，促進(jìn)S期的DNA合成，有助于細(xì)胞的有絲分裂。另外，Wan 等應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)經(jīng)花粉培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)所獲得的椰菜(Brassica oleracea)再生植株進(jìn)行DNA含量分析，認(rèn)為經(jīng)花藥培養(yǎng)所得到的植株更易發(fā)生染色體倍性變異。通過對(duì)野豌豆染色體倍性差異的分析，Kathleen等【 4】應(yīng)用FCM 與根尖染色體壓片法，對(duì)美國(guó)農(nóng)業(yè)部國(guó)家種子保藏實(shí)驗(yàn)室的45個(gè)標(biāo)記為長(zhǎng)柔毛野豌豆(V&ia villosa)的標(biāo)本進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其中的兩個(gè)標(biāo)本應(yīng)為褐毛野豌豆 pannonica)，充分說明流式細(xì)胞術(shù)在植物種質(zhì)資源鑒定中快速
而有效。由于FCM分析檢測(cè)速度快，工作周期短，獲得的信息量大，數(shù)據(jù)結(jié)果客觀準(zhǔn)確，統(tǒng)計(jì)學(xué)精度
高，并且不使用放射性污染物質(zhì)，現(xiàn)已成為細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究和細(xì)胞周期分析的主要手段。
3．2．2原生質(zhì)體分析
FCM 在原生質(zhì)體分析方面的應(yīng)用主要測(cè)定原生質(zhì)體大小、細(xì)胞壁生物合成、原生質(zhì)體與微生物的相互作用、原生質(zhì)體融合產(chǎn)物分選、被膜抗原的表達(dá)等。在植物細(xì)胞研究中主要應(yīng)用于分選出活的原生質(zhì)體，并通過分選出來的原生質(zhì)體再生出植株，其中最有意義的就是選出由原生質(zhì)體融合所產(chǎn)
生的異核體。采用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)酸橙(Citrus aurantium L．)葉肉原生質(zhì)體和甜橙(C sineniscv．Shamouti)胚性愈傷組織原生質(zhì)體電融合后再生的體細(xì)胞雜種進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有的體細(xì)胞雜種植株熒光強(qiáng)度是二倍體對(duì)照的兩倍，這說明兩者的原生質(zhì)體已經(jīng)融合。通過使用FCM 分析enod40轉(zhuǎn)染的擬南芥屬野生植物原生質(zhì)體，Guzzo等發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致前向角散射及細(xì)胞大小減少的基因有所表達(dá)，說明enod40對(duì)原生質(zhì)體具有直接作用。用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量檢測(cè)，還可以用來定位植物激素結(jié)合位點(diǎn)的空間分布，Yamazaki等用生物素化脫落酸(bioABA)來定位蠶豆氣孔保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜的脫落酸感應(yīng)位點(diǎn)，將位點(diǎn)用熒光素標(biāo)記后，在保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體表面可以觀測(cè)到熒光微粒斑點(diǎn)，通過成像系統(tǒng)成功定位脫落酸結(jié)合位點(diǎn)的空間分布情況。

3．3-3染色體分析
1975年，Gray等【 B]從中國(guó)倉鼠細(xì)胞中分離出染色體，用DNA熒光染料進(jìn)行染色，根據(jù)染料含量的
不同用流式細(xì)胞儀將單個(gè)染色體進(jìn)行分揀，開創(chuàng)了流式細(xì)胞遺傳學(xué)。由于在染色體懸液的準(zhǔn)備與單條
染色體辨別方面存在著困難，利用流式細(xì)胞術(shù)分析與分選植物染色體一直未能取得預(yù)期的效果，但人
們發(fā)現(xiàn)使用轉(zhuǎn)座系和缺失系可以將一些無法分離的染色體從復(fù)合峰中分離出來【 。1984年，De Laat
和Blass~第一次報(bào)道了用流式細(xì)胞術(shù)識(shí)別和分揀植物染色體。隨后流式細(xì)胞術(shù)被證明是一個(gè)非常有
用的工具，它能快速精確地檢測(cè)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的畸變，以及非整倍體和染色體缺失。目前已在l7
個(gè)物種中利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)染色體進(jìn)行分析與分選，包括玉米(Zea may cv．Seneca 60)、小麥(Triticumaestivum L．)、大麥(Hordeum vulgare L．)、黑麥(Secalecereale)tar231等。另外，Macas等 在1993年利用FCM對(duì)碗~_(Viciafaba L． 流式核型進(jìn)行分揀，結(jié)合PCR技術(shù)對(duì)其DNA進(jìn)行物理定位， 成功實(shí)現(xiàn)了USP基因(unknown seed protein genes)、碗豆球蛋白基因(vicilin genes)和豆球蛋白毋基因(1egumin Bjgenes)、豆球蛋白 基因(1egumin B4 genes)、假基因(pseudogenes )在相應(yīng)染色體區(qū)域上的定位。流式細(xì)胞術(shù)還可以分選出指定的染色體，用來建立染色體DNA 文庫，但目前在植物中僅有番茄
(Lycopersicon pennellii)t~和蠶豆( 口L．) 染色體DNA文庫的報(bào)道。李立家等已將流式細(xì)胞術(shù)和PCR技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用于類玉米中抗病基因類似物序列的研究。

4展望
從1930年Caspersson和Whorellt31以細(xì)胞的計(jì)數(shù)開始，試圖尋找研究細(xì)胞的新工具，到1973年
BD公司與美國(guó)斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界上第一臺(tái)商用流式細(xì)胞儀FACS I，流式細(xì)胞
術(shù)進(jìn)入了一個(gè)空前飛速發(fā)展的時(shí)代。進(jìn)入九十年代后，流式細(xì)胞術(shù)作為一門生物檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)日臻完
善，儀器的硬件平臺(tái)也已達(dá)到穩(wěn)定的技術(shù)狀態(tài)。科學(xué)家和儀器制造商又紛紛將研究的焦點(diǎn)轉(zhuǎn)向熒光
染料的開發(fā)、單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞的制備方法以及提高電子信號(hào)的處理能力上來，以拓展日趨廣泛
的應(yīng)用領(lǐng)域。

流式細(xì)胞術(shù)的強(qiáng)大生命力植根于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，正是這些日新月異、變化多樣的應(yīng)用項(xiàng)目在全球范圍內(nèi)推動(dòng)了流式細(xì)胞術(shù)的發(fā)展。目前，利用流式細(xì)胞術(shù)不但可以對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、測(cè)量基因組大小、還能分析細(xì)胞周期、進(jìn)行流式核型(染色體的DNA含量)分析、分揀染色體以及構(gòu)建染色體文庫等。由于FCM分選系統(tǒng)可提供純度較高的特異性細(xì)胞群，因此利用流式細(xì)胞術(shù)分檢純化出的染色體在分子生物學(xué)后續(xù)研究領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，例如利用PCR技術(shù)進(jìn)行物理圖譜的繪制、FISH與PRINS遺傳圖譜的繪制、植物基因組的分析、染色體蛋白的免疫定位[27-3o]等。

近年來，F(xiàn)CM作為一種日漸成熟的技術(shù)， 已經(jīng)深入到植物研究的諸多領(lǐng)域，給工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。但是，這種技術(shù)還有一些自身的缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、對(duì)操作人員要求
高以及樣品需要復(fù)雜的前處理等，這都限制了流式細(xì)胞術(shù)在植物領(lǐng)域中的應(yīng)用。然而，隨著新型多功
能流式細(xì)胞儀的研制、多參數(shù)分析技術(shù)的建立以及各種分析軟件的開發(fā)，我們相信流式細(xì)胞術(shù)作為一
種不斷完善的技術(shù)在植物學(xué)研究中將有更加廣闊的應(yīng)用前景。