用于免疫印跡的細胞裂解液的制備

通常需對不同樣品抗原的總量進行比較或確定樣品中是否存在待測抗原。在此過程中，細胞、組織或其他樣品均直接用樣品緩沖液破碎，當樣品中的染色體DNA被剪切成短片段后，經適當處理即可用于特定的電泳系統。在本例中，樣品是以適合于標準的Tris／GlycineSDS-PAGE方式制備的。

某些樣品需經剪切處理染色體DNA降低其溶液黏度，最簡便的方法是超聲處理，用浸入式探頭或杯型超聲器均可。

1．對照

免疫印跡從細胞裂解液開始就須設置兩組對照。包括含有已知抗原的陽性對照樣品和能與陰性對照抗體發生反應的細胞裂解物。

陽性對照是含有已知的或標準量的待測抗原樣品，來源于細菌或桿狀病毒超常表達系統或已鑒定的細胞系。它可提示免疫印跡是否成功，并能對抗原的相對分子量進行精確比較；如果陽性對照中抗原的量是已知的，可粗略估計出待測樣品中抗原的含量。

陰性對照給出的是非免疫抗體與待測樣品的背景讀數。若有可能，再設置一個不含待測抗原的細胞裂解液對照(例如來源于含無效基因的細胞)更利于解釋結果。

若比較多個不同細胞樣品的抗原含量，則需考慮樣品標化問題。例如，若進行有意義的比較，需校正樣品的總蛋白量，或校正細胞數。測定樣品中蛋白質濃度可用蛋白質定量的常用測定方法。樣品中若未加溴酚藍，蛋白質較易定量。并可節省樣品緩沖液。

2．準備工作

準備1個70 ℃水浴箱。

3．需要的溶液

不含DTT的Laemmli樣品緩沖液(20％SDS、10％甘油，60mmol／LTris，pH 6．8和0．01％溴酚藍)；
lm01／LDTT(—20 ℃貯存)。

4．特殊設備

若選用酵母或細菌，則需一臺超聲裝置

5．操作步驟

(1)確定需進行裂解的樣品體積。組織培養細胞(10’細胞)為1 g加l ml裂解液。稱取足夠量的組織或器官樣品，1 s加lml裂解液。將細菌或酵母細胞離心沉淀，通過與刻度試管比較，按其沉淀物體積加入裂解液。

(2)加入10倍體積的樣品緩沖液，強力混勻。用于Tris／GlycineSDS—PAGE的1X樣品緩沖液為：2％SDS、100 mmol／LDTT(取自—20 ℃存放的lmol／L貯存液，臨用前加入)、60 mm01／LTris(pH 6．8)、0．01％溴酚藍和10％甘油。

(3)對于酵母或細菌，用超聲裝置裂解細胞。用樣品緩沖液懸浮細胞，以最大的強度超聲4次，每次15～30s。在每次超聲步驟之間，將樣品轉置冰浴中15s。

(4)樣品置70 ℃水浴加熱至少5min。

(5)10 000 g離心10rain，取上清液，將其移入另一潔凈試管中。

至此，電泳樣品已準備就緒。

樣品既可立即使用也可凍存?！?0 °C存放的樣品可穩定保持數月。