昆蟲細(xì)胞--高M(jìn)OI桿病毒感染

高 MOI （ Multiplicity Of Infection ，等于用于感染的病毒數(shù)目與細(xì)胞數(shù)目的比值）感染是生產(chǎn)蛋白的最好方法。這有兩個(gè)原因。一是不用考慮 DIP （ Defective Interfering Particles ，即只包裝入部分基因組的病毒顆粒）的形成，因?yàn)殛P(guān)心的是細(xì)胞或者培養(yǎng)液中的蛋白；二是高 MOI 感染是最便于控制、重復(fù)性好的方法，以達(dá)到高的蛋白表達(dá)水平。

低 MOI 感染也可用于生產(chǎn)蛋白，但是難以控制，難以達(dá)到最高的表達(dá)量。然而病毒需要量少的確是該法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于大規(guī)模的生產(chǎn)這個(gè)優(yōu)點(diǎn)極為有利，只要它們可以可靠的復(fù)制，這因不同的重組病毒而異。

一般說來，用高 MOI 感染的方法就是將培養(yǎng)液中所有的細(xì)胞同時(shí)感染，每個(gè)細(xì)胞至少感染一個(gè)病毒顆粒。這個(gè)過程的幾率可以用 Poisson 分布來分析，簡(jiǎn)而言之，如果你想同時(shí)把所有的細(xì)胞都感染， MOI 值應(yīng)該接近 3 。由于一旦加入病毒細(xì)胞就不再生長(zhǎng)，因此你可以精確的控制感染時(shí)細(xì)胞的密度，這個(gè)密度大約應(yīng)該大約是平臺(tái)期最大密度的一半。隨著細(xì)胞株的不同，大約在 1.5~2.5 × 10⁶ 細(xì)胞 /ml 之間。

重要的是培養(yǎng)液的量要滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，否則將沒有足夠的營(yíng)養(yǎng)使細(xì)胞生產(chǎn)病毒或者蛋白。另一方面，病毒也不可以太多，以免在細(xì)胞增殖到合適密度并用掉所有營(yíng)養(yǎng)資源之前就被殺死。用高 MOI 感染的方法，這些條件比較容易優(yōu)化，只需準(zhǔn)備密度變化在 1~3 × 10⁶ 細(xì)胞 /ml 之間的一系列細(xì)胞培養(yǎng)物，以固定的細(xì)胞：病毒比例去感染細(xì)胞，篩選蛋白產(chǎn)量最高時(shí)的那個(gè)密度即可。

采用這個(gè)方法需要你使用足夠量的病毒使細(xì)胞生長(zhǎng)立即停止。病毒量可以通過進(jìn)行一個(gè)小量實(shí)驗(yàn)來確定，先使細(xì)胞達(dá)到上面確定的最優(yōu)密度，然后變化病毒的量確定感染率。高 MOI 感染的最大的缺點(diǎn)是需要準(zhǔn)備大量的高滴度病毒，這個(gè)缺點(diǎn)在大量生產(chǎn)時(shí)尤為突出。例如，如果你的病毒不能形成高滴度的溶液，只能達(dá)到 3 × 10⁷ pfu/ml 左右，你需要加相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)物 20% 體積的病毒。如果細(xì)胞的密度為 2.5 × 10⁶ ，體積為 8 升，那么為了得到密度為 2 × 10⁶ 細(xì)胞 /ml 的被感染細(xì)胞，需要加入 2 升病毒！你的細(xì)胞必須能夠生長(zhǎng)到較高的密度 --2 × 10⁶ 細(xì)胞 /ml ，并且保持對(duì)數(shù)期良好狀態(tài)，你必須加入相當(dāng)于終體積 20% 的培養(yǎng)液以達(dá)到最終體積，這是實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蝽樌M(jìn)行下去的極限。

然而，如果你可以得到高滴度的病毒以滿足感染的需要，這種方法的產(chǎn)量、可重復(fù)性非常高。因此，我建議在表達(dá)一個(gè)新的蛋白時(shí)，開始最好先試用這種方法。并且用這種方法得到的蛋白的產(chǎn)量可作為衡量其它方法（低 MOI 感染）產(chǎn)量的標(biāo)準(zhǔn)。尤其是當(dāng)你的培養(yǎng)物體積小時(shí)（小于 500ml ），這是最好的方法。

步驟

將你的細(xì)胞以 2~8 × 10⁵ 細(xì)胞 /ml 的密度分裝到搖瓶或者攪拌器中，達(dá)到搖瓶體積的 20~40% ，記得留出一些空間以待于將來加病毒。當(dāng)培養(yǎng)物的體積小于 500ml 時(shí)，我更喜歡用搖瓶。在 27 ± 2 ℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為 100~130rpm 。

第 0 天

培養(yǎng)細(xì)胞至密度達(dá)到大約 1.5~2.5 × 10⁶ 細(xì)胞 /ml ，即最大密度的一半。這可能需要多于 1 天的時(shí)間，與接種密度有關(guān)。

加入足夠的病毒，以使所有的細(xì)胞被同時(shí)感染，但是避免加入的病毒體積多于終體積 20% ，最好不要多于 10% 。加入的量取決于病毒的滴度。

如果細(xì)胞的密度為 2 × 10⁶ 細(xì)胞 /ml ，病毒的滴度為 5 × 10⁷ pfu/ml ，要達(dá)到 MOI 值為 3 ，需要加入 12% 體積的病毒。

將搖瓶放回 27 ℃搖床，培養(yǎng) 24 小時(shí)。

感染后第 1 天

計(jì)數(shù)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞大小。如果是在高 MOI 下感染，那么所有的細(xì)胞都已經(jīng)被感染。它們與第 0 天比將不會(huì)在數(shù)目上增長(zhǎng)，并且在細(xì)胞形態(tài)上顯著膨脹。此時(shí)很容易看到細(xì)胞表面變得粗糙，這是病毒正在出芽的結(jié)果。

如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目有所增多，可能是由于對(duì)病毒滴度的估計(jì)偏高，使得細(xì)胞沒有全部被病毒感染。這種現(xiàn)象在 MOI 值大于 3 時(shí)很少出現(xiàn)，因?yàn)橐话愕臈U病毒噬菌斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果通常是低估病毒的滴度。如果細(xì)胞數(shù)目的增長(zhǎng)沒有超過 25% ，可能只會(huì)影響最佳收獲時(shí)間。平均每個(gè)細(xì)胞生產(chǎn)的蛋白量也會(huì)稍低。

感染后第 2 天

再次計(jì)數(shù)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞大小。此時(shí)與第 1 天比細(xì)胞數(shù)目無論如何都不應(yīng)該再增長(zhǎng)。如果增長(zhǎng)了，你的感染可能分布不均勻，很可能是病毒滴度低造成的。

此時(shí)細(xì)胞應(yīng)該大大膨脹，細(xì)胞核占據(jù)了細(xì)胞的大部分空間。

此時(shí)可能是細(xì)胞或者培養(yǎng)液的時(shí)間了，這因不同的蛋白而異。大多數(shù)蛋白的產(chǎn)量在感染后 48~72 小時(shí)之間不會(huì)再有增長(zhǎng)。不過這需要實(shí)驗(yàn)來確定。

感染后第 3 天

再次計(jì)數(shù)細(xì)胞，估計(jì)細(xì)胞大小。此時(shí)所有的細(xì)胞應(yīng)該已經(jīng)被徹底感染，細(xì)胞膨脹并且生長(zhǎng)停止，否則就說明沒有足夠的病毒使細(xì)胞在達(dá)到平臺(tái)期之前停止增長(zhǎng)。收獲培養(yǎng)物，離心分離細(xì)胞，將培養(yǎng)液避光保存于 4 ℃，或者凍存于 -70 ℃。

通常最好將細(xì)胞沉淀凍存。我喜歡的方法是將細(xì)胞重懸于小量（比如 1/4 體積）的 PBS 或者 TBS （含有濃度為通常 5 倍的蛋白酶抑制劑）中，充分重懸后直接用微量移液器加入充滿液氮的干凈 Dewar 瓶中。滴下的重懸物遇到液氮迅速凍結(jié)形成小球，這些小球可以被分裝到 50ml 圓錐管中，凍存于 Revco 冰箱中。當(dāng)需要從細(xì)胞中純化蛋白時(shí)，只需將這些小球逐個(gè)加入到 3~5 倍體積室溫下不斷攪拌的裂解緩沖液中，它們將很快融化，使緩沖液降至接近 0 ℃。這些小球還可以用鑷子方便的轉(zhuǎn)移到 eppendorf 管中作小量實(shí)驗(yàn)。