電子顯微鏡生物標(biāo)本的制備及觀察
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
了解電子顯微鏡 的基本原理及電鏡生物標(biāo)本的制備方法和觀察。
【實(shí)驗(yàn)用品】
一、材料和標(biāo)本 家兔一只。
二、器材和儀器 H—600透射電子顯微鏡、S—450掃描電子顯微鏡、超薄切片機(jī)(AO型)、解剖鏡、震蕩器、恒溫箱、臨界點(diǎn)干燥器、JB一3型離子鍍膜機(jī)、單面刀片、銅網(wǎng)、解剖器材。
三、試劑 乙醚、2.5%戊二醛(0.1mol/L(pH7.4)二甲砷酸鈉緩沖液配制)、1%鋨酸、30%、50%、70%乙醇溶液、80%、90%、95%、100%丙酮溶液、環(huán)氧樹(shù)脂(Epon812)包埋劑、醋酸鈾染液、檸檬酸鉛染液、雙蒸水、2%單寧酸、乙酸異戊脂、液態(tài)CO2。
【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】
一、透射電子顯微鏡的標(biāo)本制備及觀察
(一)原理 電子顯微鏡是細(xì)胞生物學(xué)研究的重要工具,它以電子束為照明源,利用電子流具有波動(dòng)的性質(zhì),在電磁場(chǎng)的作用下,電子改變前進(jìn)軌跡,產(chǎn)生偏轉(zhuǎn)、聚焦,因而電子束透過(guò)標(biāo)本后在電磁透鏡的作用下可放大成像。高速運(yùn)動(dòng)的電子流其波長(zhǎng)遠(yuǎn)比光波波長(zhǎng)短,所以電鏡分辨率遠(yuǎn)比光鏡高,可達(dá)0.14nm,放大倍率可達(dá)80萬(wàn)倍。由熱陰極發(fā)射的電子在20~100千伏加速龜壓作用下,經(jīng)聚光鏡聚焦成束,投射到很薄的標(biāo)本上,并與標(biāo)本中各種原子的核外電子發(fā)生碰撞,造成電子散射,在細(xì)胞質(zhì)量和密度較大的部位,電子散射度強(qiáng),成像較暗。在質(zhì)量、密度較小處電子散射弱,成像較亮,結(jié)果在熒光屏上形成與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相應(yīng)的黑白圖像。
(二)主要結(jié)構(gòu) 電子顯微鏡由電子光學(xué)系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)三大部分組成(圖17一l,圖17—2)。
1.電子光學(xué)系統(tǒng)是電鏡的主體,對(duì)成像和像的質(zhì)量起著決定性作用。它是由電子槍、聚光鏡、樣品室、物鏡、中間鏡、投影鏡、觀察室和照像室等部分構(gòu)成。
2.真空系統(tǒng)主要是使鏡筒內(nèi)保持高度真空,一般要求達(dá)到10-4托(1托=lmmHg),是通過(guò)機(jī)械泵和油擴(kuò)散泵接力排氣及真空墊圈的密封作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。真空度可由真空表指示。由于電鏡利用高速電子束為照明源,裁要求在電子束的通道上不能有游離氣體存在,以免與氣體分子 碰撞引起電離、放電、電子散射、燈絲氧化、樣品被污染等而影響觀察效果或發(fā)生故障。
3.供電系統(tǒng)主要是提供穩(wěn)定的電源,包括高壓系統(tǒng)電源、各透鏡的電源及真空泵的電源等。
(三)透射電鏡生物標(biāo)本超薄切片的制備(以家兔肝臟為例)。
1.取材 取活兔用乙醚麻醉,迅速打開(kāi)腹腔,暴露肝臟,用鋒利的刀片切取lmm3肝組織,立即投入固定液中。取材要求迅速,通常將動(dòng)物麻醉取材。如動(dòng)物處死后取材,要在幾分鐘內(nèi)完成。取材最好在低溫條件下進(jìn)行(0~4℃),以防止動(dòng)物死后細(xì)胞缺氧發(fā)生超微結(jié)構(gòu)變化。
圖17—1 透射電鏡結(jié)構(gòu)
2.固定 把肝組織立即投入到0.1mol/L(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液配制的2.5%戊二醛中,4℃固定二小時(shí)(也可用0.1mol/L(pH7.4)的磷酸緩沖液 配制的2.5%戊二醛)。然后用0.1mol/L(pH7.4)的二甲砷酸鈉緩沖液洗三次,再放入用相同緩沖液配制的1%鋨酸中固定2小時(shí)(4℃)。固定的作用是用化學(xué)試劑使細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)如同生前狀態(tài)精確地保存下來(lái)。固定劑應(yīng)能迅速進(jìn)入細(xì)胞,穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu),使其不變形,在脫水過(guò)程中不丟失細(xì)胞成分。